酶的分子修饰课件.pptVIP

酶的分子修飾4.1什麼是酶分子修飾？通過各種方法使酶分子的結構發生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學基團（物質），特別是具有生物相容性的物質，進行共價連接，從而改變酶的結構和性質。酶分子修飾的意義提高酶的活力activity增強酶的穩定性stability降低或消除酶的抗原性immunologicalproperty研究和瞭解酶分子中主鏈、側鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構象的影響structure回本章目錄4.2酶分子修飾的基本要求和條件對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應條件的選擇以及酶學性質等方面都要有足夠的瞭解。（1）酶的穩定性熱穩定性、酸堿穩定性、作用溫度、pH、抑制劑等。（2）酶活性中心的狀況活性中心基團、輔因數等。其他如分子大小、性狀、亞基數等。酶分子修飾的條件修飾反應盡可能在酶穩定條件下進行，並儘量不破壞酶活性功能的必需基團，使修飾率高，同時酶的活力回收高。（1）pH與離子強度pH決定了酶蛋白分子中反應基團的解離狀態。由於它們的解離狀態不同，反應性能也不同。（2）修飾反應的溫度與時間嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應。（3）反應體系中酶與修飾劑的比例回本章目錄4.3酶分子的修飾方法金屬離子置換修飾,大分子結合修飾(共價/非共價)側鏈基團修飾肽鏈有限水解修飾氨基酸置換修飾酶分子的物理修飾(1)酶的金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。α-澱粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，醯基氨基酸酶分子中的鋅離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+)若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復或者部分恢復。若用另一種金屬離子進行置換，則可使酶呈現出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩定性。金屬離子置換修飾的過程a.酶的分離純化：首先將欲進行修飾的酶經過分離純化，除去雜質，獲得具有一定純度的酶液。b.除去原有的金屬離子：在經過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時，酶往往成為無活性狀態。c.加入置換離子：於去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結合，除去多餘的置換離子，就可以得到經過金屬離子置換後的酶。金屬離子置換修飾只適用於那些在分子結構中本來含有金屬離子的酶。用於金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。(2)酶的大分子修飾使用一些能與酶非共價地相互作用而又能有效地保護酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調節酶的微環境來保護酶的活力。另一類添加物就是蛋白質。蛋白質分子之間相互作用時，其表面區域內排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩定性也就增加了。非共價修飾用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價鍵連接於酶分子的表面，形成一層覆蓋層。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結合，酶活力達到原有酶活力的5.1倍共價修飾大分子修飾(共價)的過程修飾劑的選擇：大分子結合修飾採用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據酶分子的結構和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團往往不能直接與酶分子的基團進行反應而結合在一起。在使用之前一般需要經過活化，然後才可以與酶分子的某側鏈基團進行反應。修飾：將帶有活化基團的大分子修飾劑與經過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應一段時間，使修飾劑的活化基團與酶分子的某側鏈基團以共價鍵結合，對酶分子進行修飾。分離：需要通過凝膠層析