第三章核酸的分离与检测.pptVIP

问题与对策材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融问题二：DNA降解对策原因第59页，共97页，星期日，2025年，2月5日问题与对策实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒问题三：DNA提取量少对策原因第60页，共97页，星期日，2025年，2月5日核酸提取的相关说明第61页，共97页，星期日，2025年，2月5日为什么用无水乙醇沉淀DNA?在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么加NaAC或NaCL?加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再用SDS与KAc来处理?为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA?抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戌醇?为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?第62页，共97页，星期日，2025年，2月5日为什么用无水乙醇沉淀DNA?乙醇的优点：可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。

原理：DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合。第63页，共97页，星期日，2025年，2月5日在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么要加NaAC或NaCL在pH为8左右的DNA溶液中,DNA分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAC或NaCL,使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好.在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀.第64页，共97页，星期日，2025年，2月5日加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与KAc来处理?

加进去的Rnase本身是一种蛋白质,为了纯化DNA,又必须去除之,加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀,再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物,使沉淀更加完全。也可用饱和酚，氯仿抽提再沉淀，去除Rnase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好的效果。第65页，共97页，星期日，2025年，2月5日为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？ 在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。 在DNA反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用Tris-HCL(pKa=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCL系统,而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性.

第66页，共97页，星期日，2025年，2月5日如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA? 采用PEG(6000)沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同,PEG的浓度低,选择性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的浓度只需1%左右,小分子所需PEG浓度高达20%.选择性沉淀4.3Kb的pBR322质粒DNA,每毫升加入0.4毫升的30%PEG,其最终PEG浓度为12%.PEG选择性沉淀DNA的分辩率大约100bp.第67页，共97页，星期日，2025年，2月5日抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与水相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的痕量酚。（酚易溶于氯仿中）