蛋白酶活力测定.pptVIP

①pH=7.2的磷酸盐缓冲溶液A液28mlB液72mlH2O1000ml②pH=7.5的磷酸盐缓冲溶液A液16mlB液84mlH2O1000ml第29页，共55页，星期日，2025年，2月5日磷酸盐缓冲溶液pH计算pH=pKa+lg（C酸/C盐）[H2PO4-]=7.21+lg————[HPO4=]Ka2=6.17×10-8第30页，共55页，星期日，2025年，2月5日（3）硼砂—氢氧化纳缓冲溶液

pH=10A液：0.055mol/LNa2B4O7·8H2O19gNa2B4O7·8H2O1000mlB液：0.2mol/LNaOH8gNaOH 1000mlA液50mlB液43ml H2O200ml第31页，共55页，星期日，2025年，2月5日硼砂—氢氧化纳缓冲溶液的pH计算弱酸—弱酸盐缓冲体系Na2B4O7+7H2O═NaOH+4H3BO3H3BO3+H2O═B(OH)4-+H+一元弱酸Ka=5.6×10-10pH=pka1-lg（C酸/C盐）=9.24-lg（C酸/C盐）第32页，共55页，星期日，2025年，2月5日四、操作手续（一）制作标准曲线1．配制100μg/ml酪氨酸标准溶液2．配制系列浓度的酪氨酸标准溶液3.与福林试剂反应显色，测OD值4.绘制标准曲线（二）测定蛋白酶活力——实测1．缓冲溶液的配制2．底物配制3．待测酶液配制4．测定第33页，共55页，星期日，2025年，2月5日（一）制作标准曲线1．配制100μg/mL酪氨酸标准溶液0.1000g酪氨酸0.1mol/LHCL100ml容量瓶1mg/ml=1000μg/ml再移取10ml0.1mol/LHCL100ml容量瓶0.1mg/ml=100μg/ml第34页，共55页，星期日，2025年，2月5日思考题为什么酪氨酸要干燥至恒重？为什么酪氨酸要称准至0.1000g？为什么酪氨酸用盐酸溶解？为什么要先配成1000ug/ml，再配成100ug/ml？第35页，共55页，星期日，2025年，2月5日2．配制系列浓度的酪氨酸标准溶液第36页，共55页，星期日，2025年，2月5日3．系列浓度的酪氨酸显色并测OD值酪氨酸标准溶液1ml摇匀10分钟蓝色冷却1cm比色皿680nm波长5ml0.55mol/LNa2CO340℃水浴0号调零，测OD值福林试剂1ml第37页，共55页，星期日，2025年，2月5日说明（1）各试剂均用刻度移液管移取（2）显色后需冷却到室温（3）每一点测两份，ΔOD≤0.01共3×6＝18支干试管第38页，共55页，星期日，2025年，2月5日4．数据处理（1）画图求直线斜率的倒数K（2）计算K（3）直接查取（4）计算机处理，回归曲线：C=K.OD第39页，共55页，星期日，2025年，2月5日蛋白酶活力测定第1页，共55页，星期日，2025年，2月5日一、概述1．什么是酶？2．影响酶催化反应的因素3．什么是酶的活力?4．测定意义5.测定方法第2页，共55页，星期日，2025年，2月5日生物催化剂特殊催化功能的蛋白质酶的特性:（1）作用有专一性、选择性（2）催化速度快（3）反应条件温和（4）化学本质是蛋白质一种酶只作用一种底物：淀粉酶：只能催化淀粉水解→糊精、低聚糖；蛋白酶：只能催化蛋白质水解→氨基酸、肽；在激烈振荡、加热、紫外线、X-射线的照射，重金属盐作用下，它的二、三结构会发生改变。而变性，失去催化能力这种现象叫做酶的失活第3页，共55页，星期日，2025年，2月5日底物浓度pH温度时间第4页，共55页，星期日，2025年，2月5日VVmax