血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）速率法测定作业指导书.docxVIP

血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）速率法测定作业指导书

一、目的

建立血清天门冬氨酸氨基转移酶（EC2.6.1.1，简称AST）速率法测定的标准化操作流程，确保检测结果的准确性、精密度与可比性，为临床疾病诊断、治疗监测提供可靠依据，适用于临床实验室常规检测工作。

二、范围

本指导书适用于采用速率法（IFCC推荐方法）在全自动生化分析仪上进行的人血清AST活性测定，涵盖样本采集与处理、试剂准备、仪器操作、结果计算、质量控制、废物处理等全流程。

三、引用标准

《临床检验操作规程》（第四版，中华医学会检验医学分会）

IFCC（国际临床化学联合会）AST测定推荐方法

《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO15189:2012）

所用试剂与仪器的说明书

四、原理

在37℃、pH7.8的最适反应条件下，血清中的AST催化L-天门冬氨酸与α-酮戊二酸发生转氨基反应，生成草酰乙酸和L-谷氨酸。草酰乙酸在苹果酸脱氢酶（MDH）的作用下，与NADH反应生成L-苹果酸和NAD?。反应过程中NADH的氧化速率与血清中AST的活性成正比，通过监测340nm波长下NADH吸光度的下降速率（ΔA/min），可计算出AST的活性单位。

反应式如下：

L-天门冬氨酸+α-酮戊二酸→[AST]草酰乙酸+L-谷氨酸

草酰乙酸+NADH+H?→[MDH]L-苹果酸+NAD?

五、试剂与仪器

（一）试剂

试剂组成（按IFCC推荐配方）：

缓冲液（pH7.8）：Tris-HCl缓冲液100mmol/L；

底物：L-天门冬氨酸240mmol/L，α-酮戊二酸12mmol/L；

辅助试剂：NADH0.2mmol/L，MDH≥1200U/L，乳酸脱氢酶（LDH）≥600U/L（消除内源性丙酮酸干扰）；

防腐剂：叠氮钠0.05%（w/v）。

试剂要求：

试剂外观：无色或淡黄色澄清液体，无浑浊、沉淀；

有效期：按试剂说明书规定（2-8℃避光保存，有效期通常为6个月）；

开封后稳定性：2-8℃保存可稳定30天，需在试剂瓶上注明开封日期。

校准品：使用溯源至IFCC标准的定值校准血清，校准品浓度覆盖临床检测范围（如5-1000U/L）。

（二）仪器

全自动生化分析仪（如日立7600、贝克曼AU5800等），具备340nm波长检测功能，温度控制精度±0.1℃；

移液器（0.5-10μL、10-100μL），经校准合格；

恒温水浴箱（37℃±0.1℃，备用）；

离心机（转速≥3000r/min）；

冰箱（2-8℃、-20℃），用于试剂与样本保存。

六、样本采集与处理

（一）样本采集

采集对象：人静脉血，空腹或餐后均可（建议空腹8-12小时，避免剧烈运动后采集）；

采集容器：真空采血管（无抗凝剂，红色管帽）；

采集要求：严格遵循无菌操作，采血volume3-5mL，避免溶血、凝血、污染。

（二）样本处理

离心分离：采血后室温放置30分钟（避免超过2小时），3000r/min离心10分钟，分离血清；

样本保存：

新鲜血清：采集后4小时内完成检测；

短期保存：2-8℃保存可稳定24小时；

长期保存：-20℃冷冻保存可稳定1个月，避免反复冻融（≤3次）；

样本质量控制：

拒绝接收溶血、严重脂血（甘油三酯＞10mmol/L）、黄疸（胆红素＞200μmol/L）及凝固的样本；

若样本存在轻微脂血、黄疸，需进行空白校正或稀释后重测。

七、操作步骤

（一）试剂准备

将试剂从2-8℃冰箱取出，室温平衡30分钟（避免直接阳光照射）；

检查试剂批号、有效期及外观，确认无异常后，按仪器要求装载试剂（R1、R2），并在仪器系统中录入试剂信息（批号、有效期、校准因子等）。

（二）校准操作

校准频率：

新试剂启用时、更换试剂批号时必须校准；

日常检测：每周校准1次；

仪器维修、更换关键部件后需重新校准；

校准流程：

取校准品1支，室温融化后充分混匀；

按仪器校准程序，将校准品与试剂按比例加入反应杯（如校准品10μL+R1200μL+R250μL）；

仪器自动完成孵育、检测，记录吸光度变化率，计算校准曲线（通常为线性回归方程）；

校准合格标准：校准品测定值在其定值范围内，R2≥0.995。

（三）样本测定

仪器参数设置（参考，可按仪器与试剂说明书调整）：

参数项

设定值

测定波长

主波长340nm，副波长405nm（消除浊度干扰）

反应温度

37℃

反应类型

速率法（连续监测）

孵育时间

3分钟

监测时间

5分钟（记录10个吸光度数据点）

样本体积

10μL

试剂R1体积

2