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2025版微生物学细菌培养涂片鉴定技术操作模拟测试及答案

一、操作模拟测试内容

（一）实验准备阶段操作考核（20分）

1.实验前需完成实验台面消毒、个人防护装备穿戴及实验器材检查。请按以下要求操作并记录：

（1）使用75%乙醇对实验台面进行擦拭消毒，要求擦拭范围覆盖整个操作区域（包括酒精灯周围10cm范围），记录消毒时间及擦拭方式（是否采用“Z”字形交叉擦拭）；

（2）穿戴一次性乳胶手套、实验服、防护口罩，检查手套是否无破损（通过充气法测试），实验服袖口是否收紧；

（3）检查实验器材：接种环（镍铬合金材质，环直径2-3mm）、载玻片（无划痕，提前用95%乙醇浸泡30分钟后晾干）、革兰染色试剂（结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、沙黄染液，需确认试剂有效期，结晶紫无沉淀，碘液无颜色变浅）、普通光学显微镜（物镜清洁度，油镜镜头无残留香柏油）、营养琼脂平板（无冷凝水，无杂菌菌落，pH7.2-7.4）、待检标本（模拟临床痰液标本，含金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌混合菌液）。

（二）细菌培养操作考核（30分）

2.取模拟痰液标本0.1ml，进行分区划线接种至营养琼脂平板。要求：

（1）接种环灭菌：使用酒精灯外焰灼烧接种环，从环部至柄部完全红热，持续5秒，冷却3秒后接触平板边缘无熔化现象；

（2）分区划线操作：第一区占平板1/3，以密集划线覆盖；冷却后将接种环通过第一区2-3条菌线，在第二区（占平板1/3）以“之”字形划线，与第一区部分重叠；第三区通过第二区2-3条菌线，在剩余区域稀疏划线；

（3）平板标记：在平板底部用记号笔标注标本编号（2025-TEST-01）、接种者姓名、日期（2025年X月X日）、培养条件（37℃需氧）；

（4）培养：将平板倒置（盖在下，底在上）放入37℃恒温培养箱，记录培养时间（18-24小时）。

（三）涂片制作与染色操作考核（30分）

3.取培养18小时的营养琼脂平板，挑取单菌落制作涂片并进行革兰染色。要求：

（1）涂片制作：在载玻片中央滴加1滴生理盐水（约5μl），用接种环挑取1个针尖大小的菌落（约0.5mm直径），与生理盐水混合成直径1cm的均匀菌膜，避免过厚（透过菌膜可模糊看到载玻片下方字迹）；自然干燥后，通过火焰3次（距离火焰约5cm，每次1秒）固定，手背接触载玻片无灼痛感；

（2）革兰染色步骤：

①初染：滴加结晶紫染液覆盖菌膜，作用1分钟，缓慢水洗（水流从载玻片一端流入，避免直接冲洗菌膜）至无紫色液滴；

②媒染：滴加卢戈碘液覆盖菌膜，作用1分钟，水洗；

③脱色：滴加95%乙醇，倾斜载玻片使乙醇缓慢流过菌膜，脱色时间15-30秒（观察流出液无紫色时立即停止），水洗；

④复染：滴加沙黄染液覆盖菌膜，作用30秒，水洗后用吸水纸吸去多余水分（避免擦拭菌膜）；

（3）染色质量控制：同时制作已知革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌ATCC25923）与革兰阴性菌（大肠埃希菌ATCC25922）的对照涂片，确保染色结果可靠。

（四）显微镜观察与结果判读考核（20分）

4.使用光学显微镜油镜（100×）观察染色后的涂片，要求：

（1）显微镜调试：低倍镜（10×）下找到菌膜区域（视野内可见均匀分布的淡红色背景），转换高倍镜（40×）调整焦距，滴加香柏油后转换油镜（100×），通过细准焦螺旋微调至物像清晰；

（2）形态观察：记录细菌的形态（球菌/杆菌）、排列方式（葡萄状/链状/单个/成双）、染色结果（紫色为革兰阳性，红色为革兰阴性）；

（3）结果判读：根据形态与染色特征，区分混合菌液中的金黄色葡萄球菌（革兰阳性球菌，葡萄状排列）与大肠埃希菌（革兰阴性杆菌，单个或成双排列）。

二、操作模拟测试答案与评分标准

（一）实验准备阶段（20分）

1.（1）消毒操作（5分）：正确使用75%乙醇“Z”字形擦拭台面，覆盖全部区域，得3分；未覆盖酒精灯周围或擦拭方式错误，扣1-2分；未记录消毒时间，扣1分。

（2）个人防护（5分）：手套无破损（充气后无漏气）、实验服袖口收紧、口罩正确佩戴，得5分；手套破损或未检查，扣2分；实验服袖口松散，扣1分。

（3）器材检查（10分）：接种环规格符合要求（直径2-3mm），得2分；载玻片无划痕且已乙醇处理，得2分；染色试剂在有效期内且无变质（结晶紫无沉淀、碘液未变无色），得3分；营养琼脂平板符合要求（无冷凝水、pH7.2-7.4），得2分；显微镜油镜清洁（无残留香柏油），得1分；任意一项不符合，按项扣分（每项扣1-2分）。

（二）细菌培养操作（30分）

2.（1）接种环灭菌（5分）：灼烧至红热并冷却3秒后无熔化平板，得5分；未完全红热或冷却时间不足（接触平板熔化），扣3分。