质粒基因酶切实验步骤.pdfVIP

基因工程制药技术

实验四：质粒载体和目的基因的酶切

实验原理：

DNA重组是将外源DNA与载体分子进行体外连接，这样重新组合的DNA叫做重组

体或重组子。限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解

酶，又称为分子剪刀，该类酶是体外剪切基因片段的重要工具，这类酶的发现和应用促

进了以DNA重组为基础的生物工程技术的迅猛发展。没有限制性内切酶的发现和应用就

没有现代意义上的分子生物学、分子遗传学，也就不会有任何基因工程产品。


将外源DNA与载体分别进行限制性内切酶酶切反应，限制性内切酶的作用温度一般

+

为37℃，反应体系中以Mg²为唯一的辅助因子，且要求pH在7.5左右。实际操作中，

一般按照购买的商品酶的说明书进行使用。酶切完全后，回收目的基因和载体，进行体

外连接。

实验器材：恒温金属浴、小型高速离心机、微量移液器、琼脂糖电泳装置、全自动

凝胶成像仪等；

实验材料：待酶切样品（目的DNA、载体）、EcoRⅠ、EcoRI酶切缓冲液、无菌双

蒸水、1kb标准DNA相对分子质量参照物。

实验步骤：

第一步：取1支干净的灭菌的Eppendorf管，分别按以下加入：10.5uL无菌双蒸

水、2uL酶切缓冲液、7uL待酶切样品、0.5uLEcoRI。总体积为20uL。

第二步：混合反应液后，稍离心使液体聚集，37℃保温1h。

第三步：保温结束后，65～70℃10min灭活酶。

第四步：取2μL左右的反应液进行琼脂糖凝胶电泳，观察其酶切结果。

注意：

限制性核酸内切酶很昂贵，从-20℃取出要置于冰上，吸取要用新的枪头，以免污

染杂质，吸完后尽快放回冰箱。此外加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓

冲液及待切DNA混匀。反应体积中水的量要尽量少，即反应体系的体积要尽量少，一

般水解0.2～1.0μg模板DNA时，应将体积控制在20～30μL。但要保证所加酶的体

积不高于总体积的1/10，因为限制性内切酶是保存于50%甘油中的，如加酶体积高于总

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体积的1/10，则反应液中甘油
5%，而此浓度将抑制内切酶活性。