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4.位点偏爱（Sitepreference）某些限制酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。λ噬菌体DNA全长48,502bp，有5个EcoRⅠ酶切位点。切割时并非在5个位点随机进行，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍。第30页，共86页，星期日，2025年，2月5日造成位点偏爱现象的原因限制酶在切割DNA之前需要同时与两个识别位点作用；限制酶对要求作用的DNA序列有两个明显不同的结合位点，其中一个是为DNA切割时激活另一个的变构位点。第31页，共86页，星期日，2025年，2月5日一、定义二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第32页，共86页，星期日，2025年，2月5日对任意一个限制酶来说，都有其各自的最佳反应条件。缓冲液反应温度反应时间酶切反应的终止第33页，共86页，星期日，2025年，2月5日一、定义二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第34页，共86页，星期日，2025年，2月5日在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。实际上星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。第35页，共86页，星期日，2025年，2月5日引起星星活性的因素甘油浓度高（5%）限制酶过量（100U/?l）离子强度低（25mM）pH值过高（8.0）反应体系含DMSO、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等有机溶剂Mg++被其它二价阳离子如Mn++、Cu++、Co++或Zn++代替第36页，共86页，星期日，2025年，2月5日抑制星星活性的措施减少酶的用量（可避免过分酶切）减少甘油浓度保证反应体系中无有机溶剂或乙醇提高离子强度到100～150mM（但不能抑制酶活性）降低反应pH至pH7.0保证使用Mg++作为二价阳离子第37页，共86页，星期日，2025年，2月5日一、定义二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第38页，共86页，星期日，2025年，2月5日DNA重组限制酶（物理）图谱绘制突变分析（RFLP分析）限制酶的部分酶切与完全酶切第39页，共86页，星期日，2025年，2月5日第二节?甲基化酶（Methylase）第40页，共86页，星期日，2025年，2月5日一、甲基化酶的种类与识别序列二、甲基化对限制酶切的影响第41页，共86页，星期日，2025年，2月5日原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。1.????限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤。在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。M.EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同M．HpaICmCGGHpaICCGG相同第42页，共86页，星期日，2025年，2月5日2.E.coli的dam、dcm甲基化酶这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。GmATCDcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。CmCAGGCmCTGG第43页，共86页，星期日，2025年，2月5日该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。3.哺乳动物的甲基化酶第44页，共86页，星期日，2025年，2月5日E.coli中至少有3种依赖于甲基化的限制系统mcrA、mcrBC和mrr，它们识别的序列各不相同，但只识