10食工基因工程的基本技术.pptVIP

第二章;主要内容;;一、核酸提取技术;1、植物组织中基因组DNA的提取;ⅰ植物组织中基因组DNA的提取原理：

用机械研磨使组织和细胞破碎，然后加入SDS、CTAB等离子型表面活性剂，使细胞膜和核膜破裂，解聚核中的核蛋白（并与蛋白质形成混合物），然后在酚和氯仿等表面活性剂的作用下使蛋白变性，再经离心除去组织和变性蛋白，上清夜加乙醇使DNA沉淀。;再思考：

1、研磨破碎组织必须在低温下进行。

------为什么？

;作业：基因组DNA的提取实例;ⅰ质粒DNA提取方法：;ⅲ抽提出质粒的构型：;抽提出的质粒三种构型电泳结果：;二、凝胶电泳技术;琼脂糖凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳;（一）、影响电泳迁移率的因素;?操作简单；

?分辨范围：100bp-60kb；

?有效范围：200bp-50kb；

?分辨率：100bp左右;?常用于微卫星、测序分析；

?分辨范围：5-500bp；

?分辨率：1bp;?凝胶分辨DNA的能力：;4、电泳缓冲液;电泳缓冲液的选择;（二）、电泳指示剂和DNA染色剂;?DNA染色剂;（三）凝胶电泳过程;?中文名称：聚合酶链式反应;PCR操作流程;?2、PCR反应过程：;?3、PCR反应体系：;§(2)、dNTP的浓度：

常用100-200μmol/L，不能低于20μmol/L，特异性、保真性；;§(3)、模板：主要考虑纯度及使用量

对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng.;

;以普通PCR50?lreactionsolution为例);配置PCR反应液实验过程;§PCRthermalprogram（PCR反应程序设计）;6、PCR的种类;F;?（3）反向PCR：

根据已知序列扩增两侧序列的方法。;?（4）定量PCR;实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。;;????PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle6-15;????研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始??贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。;PCR实验的一般过程：;PCR技术的应用;思考题