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医学重要真菌鉴定指南

医学重要真菌的准确鉴定是感染性疾病诊断、治疗及预后评估的关键环节。临床实验室需结合形态学观察、培养特性分析、生理生化反应及分子生物学技术，针对不同真菌的生物学特性制定系统性鉴定策略。以下从基础检测方法到常见医学真菌的具体鉴定要点展开详细阐述。

一、真菌鉴定的基础检测方法

（一）直接镜检与染色技术

直接镜检是快速筛查真菌的首要步骤，通过观察标本中真菌的形态特征（如菌丝、孢子、荚膜等）为初步鉴定提供依据。常用方法包括：

1.KOH湿片法：适用于皮肤、毛发、甲屑等角质化标本。取少量标本置于载玻片，滴加10%-20%KOH溶液，覆盖盖玻片后微加热（加速角质溶解），显微镜下观察是否存在分枝分隔菌丝（如皮肤癣菌）或芽生孢子及假菌丝（如念珠菌）。

2.墨汁负染法：专门用于隐球菌属的检测。取脑脊液或组织渗出液与印度墨汁混合，隐球菌的宽厚荚膜在黑色背景下呈现透亮光晕，可与其他酵母样真菌区分。

3.染色技术：

-革兰染色：酵母样真菌（如念珠菌）呈革兰阳性，菌丝（如曲霉）细胞壁薄，染色可能不均；

-瑞氏-吉姆萨染色：适用于血液、骨髓或组织印片，可清晰显示组织胞浆菌等胞内寄生真菌的形态；

-六胺银染色（GMS）：真菌壁的多糖成分与银离子结合后呈黑色，能敏感显示各种菌丝和孢子，尤其适用于组织标本中真菌的定位；

-过碘酸雪夫染色（PAS）：真菌细胞壁的多糖被氧化后与雪夫试剂反应呈红色，与周围组织对比明显，常用于病理切片观察。

（二）分离培养与菌落观察

分离培养是真菌鉴定的核心环节，通过选择合适培养基、控制培养条件获取纯菌落，进一步观察宏观及微观形态。

1.培养基选择：

-沙堡弱葡萄糖琼脂（SDA）：基础培养基，含4%葡萄糖、1%蛋白胨，pH5.6，适用于多数真菌的分离培养。添加氯霉素（抑制细菌）和放线菌酮（抑制腐生真菌）的SDA（SDA-CAF）常用于临床标本的选择性培养；

-脑心浸液琼脂（BHI）：营养丰富，添加血液或小牛血清后可促进双相真菌（如组织胞浆菌、马尔尼菲篮状菌）的酵母相生长；

-CHROMagar念珠菌显色培养基：通过特定酶底物显色反应区分不同念珠菌（如白念珠菌呈绿色，热带念珠菌呈蓝色，光滑念珠菌呈粉色），缩短鉴定时间；

-咖啡酸琼脂：用于隐球菌属的鉴定，新生隐球菌可产生黑色素，菌落呈深棕色。

2.培养条件：

-温度：多数真菌在25-30℃（丝状真菌）或35-37℃（酵母样真菌）生长良好，双相真菌需分别在25℃（菌丝相）和37℃（酵母相）培养以观察形态转换；

-时间：酵母样真菌通常1-3天可见菌落，丝状真菌需5-14天，部分慢生长真菌（如组织胞浆菌）可能需要4周以上；

-需氧环境：多数医学真菌为需氧或兼性厌氧，毛霉属等接合菌需较高氧气浓度。

3.菌落形态观察：

-宏观特征：包括菌落大小、表面（光滑/褶皱/放射状沟纹）、边缘（整齐/锯齿状）、质地（酵母样/奶油状/棉絮状/绒毛状）及颜色（正面/背面）；

-微观特征：通过乳酸酚棉蓝染色制作玻片，观察菌丝（有隔/无隔）、孢子（分生孢子/孢子囊孢子/关节孢子）及特殊结构（假菌丝、厚壁孢子、分生孢子头）。例如，白念珠菌可见假菌丝及顶端厚壁孢子，烟曲霉可见典型的烧瓶状顶囊及单层小梗。

（三）生理生化反应

生理生化试验通过检测真菌对碳源的利用能力、酶活性等代谢特征，辅助区分形态相似的菌种，尤其适用于酵母样真菌的鉴定。

1.芽管试验：取待测菌接种于0.5ml人血清或小牛血清，37℃孵育2-4小时，显微镜下观察是否形成芽管（无分隔的管状物，与母细胞连接处无收缩）。白念珠菌95%以上阳性，其他念珠菌（如热带念珠菌）偶见假阳性，需结合厚壁孢子试验确认。

2.厚壁孢子形成试验：将菌接种于玉米吐温80琼脂，25℃培养24-48小时，白念珠菌可在假菌丝顶端或侧方形成圆形厚壁孢子，光滑念珠菌等不产生。

3.糖同化与发酵试验：通过检测真菌能否利用特定碳水化合物（如葡萄糖、麦芽糖、乳糖）产酸产气，判断菌种。常用API20CAUX系统（生物梅里埃），通过20种碳源的同化反应生成编码，结合数据库比对鉴定。

4.脲酶试验：隐球菌属可分解尿素产氨，使培养基（含酚红）由黄变粉；念珠菌属通常阴性。

5.β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）：用于区分白念珠菌（阴性）与伪热带念珠菌（阳性），后者可水解邻硝基苯-β-D-半乳糖苷生成黄色产物。

（四）分子生物学技术

传统方法受限于形态变异、培养时间及操作者经验，分子生物学技术通过检测真菌核酸序列，提供更准确