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磁分离技术在转基因检测中的应用

引言

磁分离技术是以具有超顺磁性的磁性微球为固相载体，通过表面功能基团特异性吸附及解吸附，在外加磁场作用下分离目标产物的一种新型分离技术。在磁场条件下，磁性微球能够稳定的悬浮在溶液体系中，其超顺磁性能够快速的使固液分离，而省去传统分离中离心过滤等繁琐操作，同时还可以提高分离过程中反应物之间相互作用的动力学速度。另外，磁性微球由于比表面积大，表面可偶联的配基容量也大，因而通过共聚、球表面改性后可赋予多种活性功能基团（-COOH、-COH、-NH2等），快速且特异地结合酶、细胞、抗体等生物活性物质。因此，磁分离技术在生物分离纯化领域有着广阔的研究和应用前景。磁分离技术在生物分离领域中的应用首先由RobinsonPJ等提出，将纤维素磁性微球用于酶的固定化。随后的20年，磁性微球在生物分离领域的应用发展缓慢。进入21世纪后，磁分离技术开始迅速发展，并在UgeistadJ等研究基础上相继开发了一系列的商品化产品Dynabeads。目前磁分离技术己经在细胞分类和分离、蛋白提纯、核酸分离、细菌和病毒分离及免疫检测等诸多方面展现出重要的应用价值。磁分离技术发展至今仍然面临很多问题。磁性微球自身缺陷及分离条件和环境都对生物大分子物质的分离纯化有着至关重要的影响。理想的磁性微球是磁分离技术的基础，稳定的分离环境是保证磁分离高效进行的必要条件。理想的磁性微球需要具备足够大的比表面积，表面配基的连接也要均匀，这样才能够保证对产物有高效的吸附率。因此，制备适应不同要求的磁性微球已经成为研究的热点。本文从磁性微球结构特点出发，分析其基本原理，简单阐述磁性微球在细胞、蛋白质及核酸等分离纯化中的现状，并对其在各部分的应用趋势进行总结。

一、磁性微球的结构性质和分离原理

1、磁性微球的结构和性质

磁性微球是通过适当的理化方法将无机磁性材料和有机高分子材料结合而形成的一种多功能复合材料。根据球芯和外壳材料的磁性特点可分为磁性核或磁性壳型，混合型和多层型。无机磁性材料主要有金属（Fe、CO、Ni）、铁氧体（MeO·Fe2O3、Fe3O4）、合金（FeCO）、铁酸盐等，其中Fe3O4由于磁性能好，制作工艺简单，成本低，而成为应用最广泛的磁核。高分子材料有天然与合成两类。天然高分子材料主要有琼脂糖、淀粉、明胶、纤维素、壳聚糖等；合成高分子材料主要有聚苯乙烯、聚苯乙烯醇等。目前磁性微球的制备方法主要有磁性粒子单体聚合法、磁性粒子聚合物组合法和磁性粒子聚合物原位生成法。磁性粒子聚合物组合法制备磁性微球方法简单，但制备出的磁性微球单分散性差，形貌不规则。磁性粒子单体聚合法主要是以高分子单体聚合的方法为主，相对磁性粒子聚合物组合法要复杂，制备出的磁性微球分布较宽、粒径较大或包埋磁性粒子效果差，使得后期应用受到限制。通过不同的制备方法可得到性能不同的磁性微球，再加上表面功能基团的修饰，使得磁性微球几乎可以偶联大部分生物活性物质。应用于生物磁分离技术中的磁性微球应具有合适的磁响应度、均一的粒径分布、良好的生物相容性、稳定的特异吸附表面等特性。

2、磁性微球的分离原理

磁分离技术的分离有2种方式，即直接分离法和间接分离法。直接分离法是指磁性微球表面连接的是能够特异性结合目标产物的基团，在溶液体系中特异性结合目标产物，在磁场作用下与其他物质分离。间接分离法是在分离前先对目标产物进行处理（例如抗原纯化中，首先将抗原与第一抗体连接），使其能够与磁性微球表面的基团（第二抗体）结合，在磁场作用下将携带目标产物的复合物分离出来，再借助其他手段解吸附目标产物。

二、转基因食品检测的研究进展

核酸是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，不同生物个体具有各自不同的核酸碱基排列顺序。转基因技术是在核酸水平上对DNA序列进行的重组，因此，在核酸水平上对转基因片段进行检测就显得尤为必要。近年来，随着微量DNA提取技术和PCR技术的飞速发展，转基因检测方法取得了飞跃式的进展。转基因的检测方法多种多样，但最常规的方法，也是进出口检测行业广泛应用的方法为聚合酶链式反应法（PCR法）和实时荧光定量PCR法（FQ-PCR法）。除此之外，近年来不断涌现的转基因检测新型方法，也丰富和完善了转基因食品的检测体系。

1、传统检测方法

（1）聚合酶链式反应法（PCR）

PCR方法主要包括三步：第一，高温变性，纯化后的双链DNA为模板，在94℃左右时实现双链解螺旋，以便下轮反应时与引物结合；第二，低温退火，特异性的上游引物与下游引物分别与两条单链互补配对；最后，双链延伸，由于有dNTP、DNA聚合酶和Mg2+等物质存在，DNA双链得以延伸复制。经过多次的指数型扩增，微量的模板DNA含量迅速升高。使用PCR方法进行转基因检测一般包括对内