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研究报告

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一株犬源乳酸菌的分离鉴定及其对幼龄小鼠沙门氏菌性腹泻的预防和治疗作用研究

一株犬源乳酸菌的分离与纯化

1.1.分离方法的选择

在分离犬源乳酸菌的过程中，方法的选择至关重要。首先，我们考虑到实验室的实际情况，决定采用平板划线法作为主要分离手段。该方法操作简便，能够有效区分和分离出单一菌落，适用于初次分离实验。具体操作中，我们选取了麦芽糖酵母膏琼脂（MYP）培养基作为基础培养基，因为该培养基对乳酸菌的生长具有较好的支持作用，且能够抑制其他杂菌的生长。

平板划线法分离过程中，我们选取了直径为5毫米的玻璃棒，以无菌操作技术从含有疑似乳酸菌的样品中蘸取适量菌液，在MYP平板上进行划线。划线后，将平板置于37℃恒温培养箱中培养24小时。通过观察菌落形态和颜色，我们成功分离出几株典型的乳酸菌。为了进一步验证这些菌株的纯度，我们采用了显微镜观察和菌落计数等方法，确保分离出的菌株为单一菌种。

在分离过程中，我们还对几种不同的分离方法进行了比较。例如，与稀释涂布平板法相比，平板划线法具有更高的分离纯度，且操作简便，耗时短。此外，与接触印迹法相比，平板划线法在分离乳酸菌方面具有更高的成功率。在实验中，我们曾尝试使用接触印迹法分离乳酸菌，但发现该方法分离效率较低，且操作复杂，不适用于初次分离实验。因此，综合考虑实验室条件和实验目的，我们最终选择了平板划线法作为分离犬源乳酸菌的主要方法。

2.2.分离培养基的制备

(1)在制备分离培养基时，我们优先选择了麦芽糖酵母膏琼脂（MYP）作为基础培养基。该培养基含有乳酸菌生长所需的营养成分，如麦芽糖和酵母膏，能够有效促进乳酸菌的生长繁殖。在制备过程中，我们严格遵循以下配方：MYP琼脂粉10克，氯化钠5克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，水1000毫升。通过高压灭菌后，培养基的pH值调节至6.5左右，以适应乳酸菌的生长需求。

(2)为了确保培养基的无菌状态，我们采用了高压蒸汽灭菌法进行灭菌。具体操作为，将配制好的培养基装入灭菌瓶中，封口后置于高压蒸汽灭菌器中，在121℃下维持15分钟。灭菌后的培养基在无菌环境下冷却至50℃左右，然后加入适量的无菌乳酸菌接种液。通过这种方式，我们确保了培养基中不含有任何潜在的杂菌，从而保证了分离实验的准确性。

(3)在实际应用中，我们曾遇到过培养基制备过程中的问题，如pH值不稳定、成分配比不准确等。为了解决这些问题，我们进行了多次实验和调整。例如，在pH值不稳定的情况下，我们通过添加适量的NaOH或HCl进行调节。在成分配比不准确的情况下，我们严格按照配方进行重新配制。通过不断优化和改进，我们最终制备出适合乳酸菌生长的分离培养基，为后续实验提供了坚实的基础。

3.3.分离实验的操作步骤

(1)分离实验的操作步骤如下：首先，将已制备好的MYP琼脂培养基置于37℃恒温培养箱中预热，以确保培养基在接种过程中保持适宜的温度。接着，将含有疑似乳酸菌的样品稀释至10^-7，取适量稀释液分别接种于多个平板上。在接种过程中，我们使用了无菌操作技术，确保接种环的清洁和消毒，以避免交叉污染。

接种完成后，将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中培养24小时。在此期间，我们定期观察平板上的菌落生长情况，记录菌落形态、大小、颜色等特征。经过24小时的培养，我们成功分离出几株典型的乳酸菌。为了进一步验证这些菌株的纯度，我们选取了形态最为典型的一株进行显微镜观察和菌落计数。

(2)在分离实验中，我们特别关注了接种环的使用和消毒。为了确保接种环的清洁，我们采用了酒精灯火焰消毒法。具体操作为，将接种环在酒精灯火焰上灼烧，直至其表面呈亮红色。灼烧过程中，我们注意观察接种环的燃烧情况，确保其完全灭菌。此外，我们还对接种环的冷却时间进行了控制，以避免高温对菌落生长的影响。通过多次实验，我们确定了最佳的接种环冷却时间，为分离实验的成功提供了保障。

(3)在实验过程中，我们遇到了一些问题，如菌落生长速度不一致、部分菌落出现异常形态等。针对这些问题，我们采取了以下措施：首先，对培养基和试剂进行了严格的质量控制，确保其质量符合实验要求。其次，对实验操作流程进行了优化，如调整接种环的冷却时间、控制培养温度等。此外，我们还对分离实验的实验条件进行了调整，如更换不同品牌的MYP琼脂粉、调整培养基的pH值等。通过这些措施，我们成功解决了实验中遇到的问题，提高了分离实验的成功率。

二、分离菌种的鉴定

1.1.形态学鉴定

(1)在进行形态学鉴定时，我们首先对分离得到的乳酸菌进行了宏观观察。使用显微镜低倍镜观察，可见菌落呈现出典型的表面光滑、边缘整齐的特征。根据文献报道，乳酸菌的菌落直径一般在2-4毫米之间，而我们观察到的菌落直径均符合这一范围。此外，菌落表面呈现乳白色，这