暨南大学 高等环境微生物学部分课件 环境微生物的分子分类-2015.pptVIP

Tm值的测定流程准备工作25~50℃变性前3~5℃变性完成DNA样品进行适当稀释，装入石英比色杯，塞好带有半导体点温计热敏电阻探头的塞子，另设对照组。将比色杯放置于分光光度计的带有加温装置的比色架内，固定波长为260nm。记录25℃的吸光度，然后将温度迅速上升至50℃左右，取出比色杯检查有无气泡，如有用手指轻弹去除，继续加热。停止升温，稳定5~10min后再以1℃的梯度升温。每升温1℃持续约5min，直到升温后吸光度不再增加。对吸光度以相应的温度膨胀体积进行校正，然后除以25℃的吸光度，得出相对吸光度。并绘制热变性曲线。Tm值与G+C摩尔分数之间的关系Tm值的高低取决于DNA分子中的(G+C)的含量。(G+C)含量越高，Tm值越高。G+C含量的计算由热变性曲线获得DNA的Tm值，然后使用以下经验公式进行计算1×SSC（G+C）%=(Tm－69.3)×2.440.1×SSC（G+C）%=(Tm－53.9)×2.44由上表可得：5‘到3’的GC之间Tm值远大于由3‘到5’的GC之间Tm值。相邻的核苷酸对Tm值以的值最大，即其稳定性最好。以的Tm值最低，即其稳定性最差。在三联体密码子中，以的Tm值最低。因此，生命体以为RNA聚合酶的结合点，以UAA为终止密码子。5‘GC3’3‘CG55‘TA3’3‘AT55‘UAA3’3‘AUU55‘TA3’3‘AT5G+C含量的摩尔分数G+C含量变动浮动较宽每一种细菌G+C含量变化范围很小G+C含量为细菌分类学上一指标2.2G+C含量在细菌分类中的作用G+C含量的摩尔分数测定的主要作用在于否定取向G+C含量在一定范围内不同的菌株两者不是同种的细菌G+C含量在一定范围内相同或相近的菌株两者为同种或相近的细菌不一定一定G+C含量的摩尔分数差G+C含量差别在20%~30%G+C摩尔分数差在10%~15%G+C摩尔分数差大于5%G+C摩尔分数差别在2%以内无意义不属于同一种属于不同属属内的不同细菌未知细菌认识流程形态解剖学生理生化性状测定G+C含量对于未知细菌准确的鉴定与认识对于表型相似的疑难菌株的鉴定、新菌的命名和建立一个心的分类单位，G+C含量摩尔分数测定是一项重要的必不可少的分类鉴定特征2.3测定基因组DNA的G+C含量细菌的培养和菌体的收集细菌的破壁DNA的提取DNA的定量测定和纯度检查DNA的保存DNA的G+C含量测定细菌的破壁化学方法溶菌酶取25ml菌悬浮液加入10mg溶菌酶37℃水浴处理一小时加入SDS溶解得到DNA破碎液细菌的破壁物理方法反复冻融超声波破碎用玻璃珠振荡用玻璃粉混合研磨挤压菌体使之受械压力而破裂DNA的提取氯仿提取法经典方法苯酚提取法苯酚氯仿混合柱色谱法常用方法羚基磷灰石柱色谱法琼脂糖4B柱色谱法氯化铯密度梯度离心法提取方法苯酚氯仿混合提取法悬于40~50ml的SE溶液细菌的破壁震摇5min，离心10min湿菌体氯仿-异戊醇振摇5min离心10min取水层加RNase，置37℃保温加等体积氯仿-异戊醇，振摇5min离心10min取水层加2倍体积遇冷的95%乙醇用玻璃棒卷出DNA取水层加适量ISSC或O.ISSCDNA低温保存备用重复操作1~2次，至中间物蛋白质为止苯酚氯仿提取法操作使用溶液1、LB液体培养基，PH调到适当，高压灭菌2、SE溶液：含有0.15mol/L氯化钠和0.1mol/LEDTA(ph8.0)3、20%SDS4、溶菌酶5、5mol/L过氯酸钠6、氯仿-异戊醇：氯仿：异戊醇=24:17、20倍的SSC溶液：含0.3mol/L柠檬酸钠和3mol/L的氯化钠8、10mg/mLRNA酶：称取10mg核酸核酸酶A于灭菌的EP管内，加入1ml100mmol/LPH5.0的醋酸钠溶液，即为10mg/mLRNA酶，为了消除脱氧核酸核酸酶的影响，置于80℃的水浴中10min或者100℃水浴中2min，然后于-20℃下保存9、无水乙醇和70%的乙醇10、TE溶液：含10mmol/LTRIS.HCl(PH8.0)和1mmol/LEDTA11、10mg/mL溴化乙锭染色液12、溴酚蓝电泳上样缓冲液DNA的定量测定和纯度检查DNA的定量测定分光光度法凝胶电泳法