复旦 生物大分子bio-coures-8.pptVIP

糖苷酶及其在结构分析中的应用糖蛋白的短分支结构分析可用外切糖苷酶顺序水解。内切酶也可用于寡糖链的释放获得结构信息。糖蛋白及糖胺聚糖的结构分析中常用助外切糖苷酸。酶消化法的优点是只需非常少量的样品，且可显示糖苷键异头异构型的信息。外切糖苷酶专一释放寡糖或糖蛋白非还原端单糖，是测定糖链顺序的重要手段，根据糖苷酶的专一性可确定糖苷键异头异构型，也可用于可溶性或膜联糖蛋白糖链的功能研究。外切酶的特异性主要针对非还原端单糖及其糖苷键的构型，在某些情况下，糖苷键的位置及糖苷配基也有重要影响，但绝对依赖于该酶所攻击的糖苷键异头异构型，如有?-吡喃糖苷键与?-异头物的特异性。在大多数情况下，外切糖苷酶只作用于单一类型的末端糖基，如?-岩藻糖苷酶只作用于?-连接的岩藻糖（Glc）苷键。也有一些己糖胺糖苷酶既可水解N-乙酰-D-葡萄糖胺，也可水解N-乙酰-D-半乳糖胺糖苷键。位置异构对外切酶的影响变化较大，如法螺和蝾螺来源的?-岩藻糖苷酶可水解糖蛋白中已知的一切岩藻糖苷键，但迅雷芽孢杆菌等来源的?-岩藻糖苷酶只能水解Fuc?(1-2)Gal糖苷键。因此外切糖苷酶的特异性差异可用来区分位置异构。除了连接键的位置，糖苷配基的其他结构特性对外切糖苷酶的作用也有重要影响，如刀豆?-半乳糖苷酶可水解Gal?(1-4)GalNAc，不水解Gal?(1-4)[Fuc?(1-3)]GlcNAc，这是由于?-岩藻糖基对酶与寡糖底物的接近具有空间位阻效应。更复杂的空间位阻效应还涉及与外切酶作用位点间隔数个残基的单糖，故若用外切酶释放单糖失败，不能排除非还原端存在此单糖的可能性。拟糖蛋白的合成和应用酶促的糖类和蛋白质的连接反应称为蛋白质糖基化(glycosylation)。但是蛋白质和糖可以发生许多类型的非酶反应。随着有机合成的进展，糖类连接到蛋白质上的方法也不断增多。这些将糖类连接到蛋白质肽链上的非酶过程被定名为糖化(glycation)。在这些非酶反中，有一种反应在生物体内也能进行，这就是单糖或寡糖的还原端羰基和肽链中的?或?氨基作用，生成西夫(Schiff)碱。因体内没有还原剂，所得的产物经重排反应成为稳定的化合物；而在体外，加了还原剂，就成为还原胺化(reductionamination)反应。非酶过程得到的糖类和蛋白质的复合物，被统称为neoglycoproteins(拟糖蛋白)。拟糖蛋白和天然的糖蛋白主要有以下几点不同：首先，糖和肽连接方式不同。在天然糖蛋白中，糖链几乎都是接在肽链中的天冬酰胺(N-糖苷键)和丝氨酸或苏氨酸(O-糖苷键)的残基侧链上；而拟糖蛋白中，和糖连接的残基经常是氨基，也可是羧基和酚基、咪唑基等芳香侧链。其次，每种天然糖蛋白肽链结构确定糖链的数目(即糖含量)基本上是恒定的，各种糖蛋白不但肽链的结构完全不同，糖含量也各异，并且它们的糖链结构也经常不同；而拟糖蛋白中，一旦选定了某种蛋白质，就可以接上不同含量的，即不同个数的单糖或寡糖，这就可以不改变肽链的结构，而仅改变糖的含量。第三，天然糖蛋白不能任意改变蛋白质中糖的种类，也就是说天然糖蛋白中糖的种类仅仅限于十几种；而拟糖蛋白中糖的种类可以任意改变。总之，对拟糖蛋白而言，可以人为地选定所需的肽链的结构，又可以主观地改变糖或糖链的种类及含量，即可根据需要对各种肽链和各种糖链进行组合，进而研究糖蛋白糖部分和肽部分的结构与功能的关系。由此，拟糖蛋白已成为复合糖类研究中常用的工具之一。在合成方法上，拟糖蛋白和固定化蛋白质有许多共同之处。目前偶联固定化所用的载体中有相当多的数量和种类是多糖，如交联琼脂糖等。广义而言，以糖类为载体偶联所得的固定化酶或其他固定化蛋白质，可以归于拟糖蛋白之列。合成拟糖蛋白所选用的蛋白质都相对简单，即本身为不含有糖类或其他成分的蛋白质。目前用得最多的是牛血清白蛋白(BSA)，因为它的来源方便、价格低廉。也有使用其他的蛋白质，例如溶菌酶等。为了特殊的目的，也可将一些糖分子接到特定的蛋白质分子上，例如将葡萄糖接到血红蛋白上，以用于糖尿病的诊断等。不仅可以将糖类连接到蛋白质上，也可将糖类连接到多聚氨基酸(如多聚赖氨酸)上；既可用L-型多聚氨基酸，也可用D-型的多聚氨基酸。最近还有拟糖脂(neoglyco1ipids)的合成。利用蛋白质和糖中的氨基和羧基间的反应，均可借鉴多肽合成的技术。由于这些反应生成了肽键(酰胺键)，因此由蛋白质到拟糖蛋白电荷数目有所改变。有时电荷的多寡也会影响到其他的一些性质。拟糖蛋白已成为糖复合物中重要的研究工具和探针，主要是作为人工配体，用于糖结合蛋白的分离纯化，研究糖结合蛋白于机体和细胞中的存在和分布、糖结合蛋白的结合特性和专一性、糖结合蛋白的结构和功能。重氮盐偶合法最经典的，也是迄今用得最广泛的方法。这种方法