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实体瘤常见驱动基因DNA和RNA高通量测序共检专家共识(2025版)

一、适用人群与检测目标

实体瘤患者DNA与RNA高通量测序（NGS）共检的核心目标是通过同步分析基因组DNA变异（如单核苷酸变异/SNV、插入缺失/Indel、拷贝数变异/CNV）与转录组RNA异常（如基因融合、可变剪接、表达量改变），全面捕捉驱动肿瘤发生发展的关键分子事件，为精准治疗提供依据。

适用人群包括：

1.初诊晚期/转移性实体瘤患者：需明确分子分型以指导一线靶向/免疫治疗（如非小细胞肺癌需检测EGFR、ALK、ROS1、NTRK融合；结直肠癌需检测RAS/RAF状态）；

2.靶向治疗耐药或疗效不佳患者：需识别获得性耐药机制（如EGFR-TKI耐药后的MET扩增、HER2扩增或C797S突变；ALK-TKI耐药后的ALK二次突变或新融合）；

3.早期实体瘤高复发风险患者：需通过分子特征评估复发风险（如乳腺癌的HER2低表达、结直肠癌的微卫星不稳定/错配修复缺陷状态）；

4.疑似遗传性肿瘤患者：需区分胚系/体细胞变异（如BRCA1/2变异在卵巢癌、乳腺癌中的遗传相关性）；

5.临床研究入组患者：需通过多组学数据筛选符合条件的受试者（如针对NTRK融合、RET融合的泛癌种临床试验）。

优先推荐共检的瘤种：肺癌（尤其是腺癌）、结直肠癌、乳腺癌（HER2低表达型/三阴性）、胃癌、肝癌（胆管细胞癌）、胰腺癌、肉瘤（如尤文肉瘤、软组织肉瘤）及儿童实体瘤（如神经母细胞瘤、肾母细胞瘤）。

二、样本要求与预处理规范

（一）样本类型与采集

1.组织样本：为首选检测样本，包括手术切除组织、活检组织（穿刺/内镜）及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。新鲜/冷冻组织需在离体30分钟内保存于-80℃或RNAlater中；FFPE组织需使用10%中性缓冲福尔马林固定（固定时间6-48小时，避免过度固定导致核酸断裂），石蜡块厚度≤4mm，切片用于HE染色确认肿瘤细胞占比（≥20%，小标本可放宽至10%但需备注）。

2.液体活检样本：适用于无法获取组织或动态监测的患者，包括血浆（ctDNA）、浆膜腔积液（如胸腔积液、腹腔积液）。血浆需采用EDTA-K2抗凝管采集（5-10ml），2小时内4℃离心（1600g×10分钟，转移上清后再次16000g×10分钟），分离血浆于-80℃保存；浆膜腔积液需在采集后30分钟内离心（1500g×10分钟），沉淀细胞用于DNA/RNA共提。

（二）核酸提取与质量控制

1.DNA提取：组织样本采用磁珠法或柱提法，FFPE样本需增加脱蜡步骤（如二甲苯处理）；ctDNA提取需使用无DNA酶污染的试剂，避免外源性DNA污染。DNA质量要求：浓度≥10ng/μl（组织）或≥0.5ng/μl（ctDNA），OD260/280在1.8-2.0之间，片段长度（FFPEDNA）主峰≤500bp（通过Agilent2100Bioanalyzer或QubitFragmentAnalyzer检测）。

2.RNA提取：新鲜/冷冻组织使用Trizol法或柱提法（需添加RNase抑制剂）；FFPE样本采用专用FFPERNA提取试剂盒（需去除石蜡残留）。RNA质量要求：浓度≥50ng/μl（组织）或≥10ng/μl（浆膜腔积液细胞），OD260/280在1.8-2.1之间，RIN值（RNA完整性数）≥2.0（FFPE样本可放宽至≥1.5但需标注），28S/18S比值（新鲜样本）≥0.7。

三、测序技术与数据质控

（一）测序策略与平台选择

1.DNA测序：采用杂交捕获法（覆盖范围广，适合大Panel）或扩增子法（适合小Panel，灵敏度高）。推荐使用IlluminaNovaSeq/X10（PE150）或ThermoFisherIonTorrent（半导体测序）平台，目标区域覆盖深度≥500×（热点区域如EGFR外显子19/21≥1000×），平均测序深度≥1000×（ctDNA需≥5000×）。

2.RNA测序：推荐靶向RNA捕获测序（覆盖已知融合基因断点、可变剪接区域及关键基因表达定量区域）或全转录组测序（WTS，适合探索性研究）。平台选择IlluminaNovaSeq（PE150），测序数据量≥20Mreads（靶向RNA≥1Mreads），确保融合基因检测的灵敏度（断裂点覆盖深度≥50×）。

（二）数据质控标准

1.原始数据质控：去除接头污染（接头占比≤1%）、低质量reads（Q30≥85%）及人源外污染（如细菌/真菌序列占比≤0.5%）。

2.比对与覆盖度：DNA数据比对至GRCh38/hg38（含decoy序列），目标区