CN106596608A 一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂及其制备方法 （河南科技大学）.docxVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN106596608A

(43)申请公布日2017.04.26

(21)申请号201610965957.9

(22)申请日2016.11.01

(71)申请人河南科技大学

地址471000河南省洛阳市涧西区西苑路

48号

(72)发明人王小东孙会忠宋月芹

(74)专利代理机构洛阳公信知识产权事务所

(普通合伙)41120代理人程茗

(51)Int.CI.

G01N23/22(2006.01)

权利要求书1页说明书4页附图3页

(54)发明名称

一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂及其制备方法

(57)摘要

CN106596608A一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂及其制备方法，所述粘片剂的成分为每100ml中含鸡蛋清3-5mL和糯米粉乳液5-7mL,余量为蒸馏水；制备方法为，分别取3~5mL鸡蛋清和5-7mL糯米粉乳液放于烧杯，用无菌水定容至100mL,混匀，再用0.22μm规格的一次性针头过滤器过滤，滤液即为粘片剂；采用所述粘片剂制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法，包括收集菌体、固定、粘片、脱水、置换、临界点干燥、粘台和离子溅射的步骤；本发明解决了细菌扫描电镜观察实验中的脱片和混杂现象，针对细菌扫描电镜

CN106596608A

CN106596608A权利要求书1/1页

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1.一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂，其特征在于：其成分为，每100ml中含糯米粉乳液5-7mL和鸡蛋清3-5mL,余量为蒸馏水；

所述糯米粉乳液的制备：称取糯米粉5g,130℃烘干1h后，研钵充分研碎，放入50mL离心管中，加40mL蒸馏水，涡旋振荡器震荡20min后，静置30min,上清液即为糯米粉乳液。

2.如权利要求1所述粘片剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

分别取3-5mL鸡蛋清和5-7mL糯米粉乳液放于烧杯，用无菌水定容至100mL,混匀，再用0.22μm规格的一次性针头过滤器过滤，滤液即为粘片剂，于4℃保存，备用。

3.采用权利要求1所述粘片剂制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)收集菌体：将细菌材料经液体摇床培养24-26h,获取旺盛生长的菌液；取培养好的菌液2ml,移入10ml无菌离心管，离心，弃上清，留沉淀菌体；在沉淀加入5mlpH7.0、0.02mol/L磷酸缓冲液悬浮漂洗5min,离心，再用5ml无菌水漂洗5min,离心得菌体沉淀；

(2)固定：向菌体沉淀中加入1.5ml质量浓度2为.5%戊二醛水溶液，轻柔吹吸悬浮菌体，4℃固定6-12h,离心，弃上清，留沉淀，加入2mL粘片剂悬浮菌体；

(3)粘片：将1片切割成5-7mm方块的载玻片小片投入步骤(2)的粘片剂菌体悬浮液中，轻轻晃动，使载玻片在菌悬液中翻转1-2次，之后静置5min,用镊子捞出载玻片小片，垂直放置，自然晾干；

(4)脱水：将步骤(3)中粘有菌体的载玻片小片依次用梯度叔丁醇，即从低体积浓度梯度叔丁醇到高体积浓度梯度叔丁醇，进行脱水，每个梯度10-15min;

(5)置换：向步骤(4)中加入1.5ml乙酸异戊酯置换出菌体中所含的叔丁醇，连续进行两次，每次20-30min;

(6)临界点干燥：将步骤(5)载玻片小片放入临界点干燥仪舱室中进行干燥2-2.5h;

(7)粘台：将干燥后的载玻片小片直接粘于电镜样品台双面胶上；

(8)离子溅射：对粘有菌体材料的载玻片小片进行喷金镀膜后，即得到扫描电镜细菌超微形态观察片，置于扫描电镜中进行观察，拍照。

4.如权利要求3所述制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中所述离心，为6000-10000r/min离心5min。

5.如权利要求3所述制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法，其特征在于：步骤(3)中所述自然晾干的时间为2min以内。

6.如权利要求3所述制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法，其特征在于：步骤(4)所述梯度叔丁醇的体积分数分别为30%、50%、70%、85%、95%、100%,其中体积分数为100%叔丁醇进行脱水2次。

CN106596608A