CTAB法胭脂萝卜总DNA提取研究 .docVIP

【标题】CTAB法胭脂萝卜总DNA提取研究 【作者】魏 玉 翠 【关键词】胭脂萝卜? CTAB? DNA 【指导老师】江 波 【专业】生物科学 【正文】1.前言色素分为天然色素和合成色素，天然色素种类繁多，原材料成本低，色调自然，具有无毒和营养价值高等特点。合成色素多是苯胺类化合物，用作食品添加剂会扰乱人体的正常代谢，使组织细胞形成肿瘤，具有致癌和致畸性，导致多种疾病。因此，许多发达国家已经禁止使用合成色素[1]。以胭脂萝卜肉质根为原料提取的天然红色素—胭脂红色素，属于类黄酮系花青素类天然色素，可作为天然食用色素逐步取代合成色素的最优品种。但目前，胭脂萝卜种性退化明显，品种纯度不高，出现了萝卜颜色变白，即“花心”的现象，直接造成了品种特征表现不一致，抗逆力减弱，产量降低，红色素含量降低的状况，特别不利于加工提取色素[2]。因此，急需对其遗传特性进行纯化，强化品种特性。而DNA作为遗传物质，快速提取高分子量、高纯度的DNA，是进行遗传转化、基因文库的构建、核酸分析等研究的前提。对于胭脂萝卜来说，总DNA的提取、纯化有一定困难。因此，建立一种大量制备高纯度胭脂萝卜总DNA的有效方法对于遗传学、分子生物学及生物技术育种将是十分必要的。本研究则以CTAB法为基础，试图通过优化条件找出一种快速提取高纯度的胭脂萝卜总DNA方法[3]。2. CTAB法胭脂萝卜总DNA提取研究[4,5]2.1实验材料采自涪陵区农科所的胭脂萝卜完整植株，材料取回后于-20℃冰箱中保存备用。2.2实验方法2.2.1实验方案表2-1实验方案编号处理 1 2 3 4 5 6样品?(g) 1 1 1 2 2 2STE?(ml) 3 3 0 3 3 010×CTAB ﹢ - - ﹢ - -?注：“﹢”是指在抽提时加入1/10体积的10×CTAB与9/10体积氯仿/异戊醇（24：1）混合抽提。2.2.2基因组总DNA粗提取（1）将研钵进行高压蒸汽灭菌，并烘干放入冰箱（4℃）备用。（2）将预先灭菌的研钵放入雪花冰中，加入适量二氧化硅和PVP。（3）称取适量的胭脂萝卜叶片放入研钵中，进行快速研磨。（4）将磨细的样品迅速移入5ml离心管中，加入适量β-巯基乙醇和3ml STE，摇匀后4000 r/min冷冻离心10min，去上清液。（5）向离心管中加入1.5ml的2×CTAB裂解液，使沉淀溶解，置于65℃水中，水浴45 min；（在水浴过程中隔一段时间就轻轻的颠倒混匀离心管，使样品充分裂解。）（6）取出离心管加入等体积抽提液，轻轻颠倒混匀，然后静置等沉淀完全，上清液析出充分为止。（7）将上清液转入2ml的离心管中，加入等体积抽提液，轻轻颠倒混匀约一分钟后，10000 r/min冷冻离心10min。（8）重复（7）步操作1次，直至加入抽提液后看不到中间层有任何杂质为止。（9）取上清液在5ml的离心管中，加1/10体积3M NaAc，混匀后再加2倍体积的冰乙醇，放入-20℃的冰箱中沉淀至少一个小时（可过夜）。（10）观察结果，如若明显有白色絮状物就直接勾出移入1.5ml的离心管中，若不明显，就直接转移到1.5ml的离心管中，12000r/min离心10min。（11）离心后弃上清液，用70%冰乙醇清洗，10000 r/min离心5min。（12）离心后弃上清液，将带有沉淀的离心管用冷风吹到没有乙醇味。（13）加入1×TE溶液50μl溶解DNA，放于-4℃冰箱保存以备纯化和检测。2.2.3 DNA粗提物的纯化（1）将上面粗提物加入适量10mg/ml RNase，使RNase终浓度不低于50μg/ml。（2）稍稍混匀，将其放置于37℃水浴锅中保温1h。（3）取出，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提一次去RNase，离心10min。（4）吸取上清液,?加入1/5体积的10mol/L NH4Ac，再加入2倍体积的预冷的无水乙醇，稍混匀，置于-20℃中30～60min。（5）冷冻离心（6000r/min）20min，去上清。（6）用70%乙醇漂洗沉淀两次，放置于超净工作台上吹干，闻起来无乙醇味即可。（7）视其DNA量的多少加入适量0.1TE缓冲液将之溶解，分装后放入-20℃冰箱保存或4℃待用，用于DNA检测。2.2.4?基因组总DNA的含量及纯度测定2.2.4.1琼脂糖凝胶电泳检测　检测DNA是否存在，是否有降解现象，DNA经限制性内切酶酶切后其产物的大小，目前应用最为广泛的检测 DNA技术是琼脂糖凝胶电泳。（1）配置好0.8%?(W/V)?琼脂糖凝胶，加热融化，用玻棒轻轻搅拌混匀后冷却至60℃，加入Goldenview染料，混匀。（2）缓缓到入两端已封好的平板中，注意要保证凝胶中