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从一次性采血50 ml到CIK足量回输方法探讨 南京大学医学院 附属鼓楼医院肿瘤中心 目录 CIK简介 CIK作用 CIK适用范围 CIK在临床应用时常规制备方法及缺点 CIK在我科的应用 什么是CIK CIK（Cytokine-induced Killer）是一种用外周血单个核细胞（PBMC）在体外经过多种细胞因子培养激活后获得的非MHC限制性的对肿瘤细胞具有高效溶解毒性的T细胞。 主要效应细胞为CD3+ CD56+ 功能特点:杀瘤谱广、效率高 CIK细胞的由来 既往用于免疫治疗的效应细胞 LAK CD3AK TIL CTL CIK是1991年由美国斯坦福大学在过去的免疫效应细胞的基础上制备的一种新型免疫活性杀伤性细胞。 CIK作用 消灭微小残留病灶 自体骨髓移植的体外净化 治疗某些化疗不敏感的肿瘤 不宜手术且对化疗和放疗禁忌的肿瘤患者 CIK的适用范围 肾癌、恶性黑色素瘤、肝癌等化疗不敏感肿瘤及白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等血液肿瘤 手术、放疗、化疗或造血干细胞移植后的肿瘤患者体内微小残留病灶的清除 某些不适合手术，对化疗和放疗不敏感，出现耐药现象的年老体弱肿瘤患者 恶性胸、腹腔积液 CIK在国内的应用情况 全国各地许多医院已在进行临床实验及治疗 北京大学人民医院、第一医院、肿瘤医院 天津医科大学附属肿瘤医院 第一军医大学附属南方医院 …… 他们的CIK制备方法 分离方法：血液细胞分离机采集患者PBMC或一次性采血200mL以上分离PBMC 进行培养 培养方法：应用IFN-γ联合OKT3单抗 、IL-2 进行诱导、扩增，当CIK达到5×109 时，自体回输 这种方法制备CIK缺点 培养方式：直接导致细胞扩增倍数低，有时仅扩增10倍左右，因而需要分离出足够数量的CIK前体细胞，故其采用上述方法分离PBMC 治疗成本：血液细胞分离机采集患者PBMC一次须花费2500元，使治疗成本大大提高 一次性采血200mL法使患者失血增多，长期治疗可导致慢性失血及贫血 迫在眉睫的问题 如何从少量的外周血制备足够数量的CIK以满足临床治疗需要？ 答案 关键是如何使CIK能够在体外大规模扩增 CIK在我科的应用 我们在南京市医学重点课题立项的支持下于2002年5月开始进行CIK治疗的基础及临床研究 目的：寻求有效方法一次性采血50 ml使CIK在体外能够大规模扩增，满足临床治疗需要 从一次性采血50 ml到CIK足量回输方法探讨 前期研究发现：目前正在许多家医院应用的CIK培养法即传统方法：D1：加入终浓度为1000U.ml-1的IFN-γ； D2：加入终浓度为100ng.ml-1的OKT3单抗,1000U. ml-1的IL-2，而后每隔1~2d加入新鲜的含IL-2 1000U.ml-1的完全培养液。这种培养方式直接导致细胞扩增倍数低，有时仅扩增10倍左右 本研究目的 寻求有效方法使得一次性采血50 ml制备的CIK（cytokine- induced killer, CIK）足以满足临床过继性细胞免疫治疗需要 50 ml外周血分离获得5×107-1×108PBMC 细胞因子培养 一次细胞免疫治疗需要5×109 CIK 材料与方法 病例选择：晚期恶性肿瘤患者10例，其中恶性黑色素瘤4例，肾细胞癌3例，原发性肝癌3例。抽血前均获得知情同意。 培养用主要试剂 ：RPMI1640，10%AB型人血清，PHA，IL-2，OKT3单抗，IL-4，GM-CSF CIK培养：A培养法： B培养法： A、B两种培养方法 50 ml外周血 观察指标 比较A、B两种培养方式下 CIK的增殖速度 培养前后免疫表型变化 细胞周期分布情况 对白血病细胞株K562的杀瘤活性。 结果（CIK扩增）Figure1. Expansion of CIK cells only from 25cm3 PB cultured by two methods 结果（CIK表型） Figure2. Phenotype of CIK cells before and after cultured on day 15 in both groups. 结果（CIK周期分析） Figure3. Cell cycle of CIK cells before and after cultured on day 15 in both groups. 结果（CIK杀瘤活性分析） Figure4. Cytotoxic