豌豆种子萌发过程中脲酶的动力学研究.docVIP

【标题】豌豆种子萌发过程中脲酶的动力学研究 【作者】唐 飞 【关键词】豌豆??脲酶??活性检测??底物浓度??温度 【指导老师】何士敏 【专业】生物科学 【正文】1. 引言1.1豌豆与脲酶概况豌豆是世界各地广泛种植的主要食用豆之一,资源丰富。豌豆的合理栽培与否直接影响着豌豆的生产和质量。豌豆也是我国的主要经济作物之一，以高营养价值、价格低廉而为广大消费者所青睐。豌豆含有丰富的蛋白、脂肪类营养成分。豌豆根据用途可分为粮用豌豆、食用嫩豆粒的菜用豌豆(甜豌豆)及食嫩荚的菜用豌豆(荷兰豆)[1]。粮用豌豆和甜豌豆所结豆荚的内果皮上有一层透明革质膜,坚硬不可食用,故称为硬荚豌豆;食用嫩荚的豌豆又称作软荚豌豆。豌豆蛋白质含量24.8%,比小麦、玉米高2~3倍,除食用外也是优质饲料近年来随着人民生活水平的提高，市场上对于豌豆需求量越来越大。脲酶特异性地促使脲水解释放出氨和二氧化碳，分子量约为483.000，等电点为4.8，最适pH7.0。脲酶广泛分布于植物界的种子中，某些微生物中也有，但以刀豆和大豆中含量较丰富[2]。脲酶在豌豆种子栽培过程中可能起着重要的作用，可能直接影响豌豆种子对环境中尿素的利用率，从而影响豌豆的产量。脲酶活性越大，栽培中的豌豆种子更能很好地利用环境中的尿素。而影响脲酶活性大小的因素很多，因此，研究脲酶的测定方法以及脲酶对植物的合理栽培是否具有指导意义越来越受到广大科研工作者的重视。1.2研究现状及目的意义简速法，又称简速大豆脲酶活性测定法，是美国道尔逊大豆加工厂建立的一种大豆脲酶测定方法，目前已经是国际最常用的大豆脲酶检测方法之一[3]。脲酶在适宜条件下可水解尿素生成铵盐，在碱性条件下，铵盐转变为氨，利用氨气敏电极测定单位时间内由脲酶水解尿素所产生的氨数量即可定量表示大豆脲酶活性的高低，这就是氨气敏电极法测定脲酶活性的原理[4]。徐茂军等就利用了这一原理建立了一套大豆脲酶活性测定方法。用玻璃电板电位法研究了大豆及脲酶制剂中脲酶活力的测定和酶的反应动力学，测定了米氏常数Km?以及酶催化反应最大速度Vm，方法快捷简便[5]。电导法也是测定脲酶活性的有效方法之一，其原理与玻璃电极法相似[6]。pH增值法是将大豆试样与尿素缓冲溶液混合,?在30℃下,30min?后,来测定溶液的pH值[7]。用滴定法和pH增值法测定了大豆粉在80℃和135℃下分别热处理30、60、90、120、150、180min的脲酶活性，并用0.2%KOH溶解法测定了大豆粉在不同热处理下的蛋白质溶解度,?结果表明,?同一样品用滴定法和增值法测得的脲酶活性在数值上不相等[8]。尿素在脲酶的催化作用下水解生成氨，其反应速度在温度和底物浓度等条件确定的情况下，与脲酶的活性成正比。生成的NH3经H3BO3接收，用标准硼酸溶液滴定检出[9]。脲酶用途广泛，可用于医疗诊断，环境监测，工业生产等诸方面[4]。在不同温度、不同蒸汽添加量以及不同的压力环直径条件下，挤压膨化对大豆中脲酶活性有影响。试验结果表明：膨化温度在120℃时，大豆中的脲酶活性被严重破坏[11-12]。在不同温度条件下,?膨化加工对大豆中脲酶活性和蛋白质溶解度有着直接的影响[13]。豆浆中的脲酶在90℃以上才能完全被灭活[14]。底物浓度对脲酶反应速度的影响：0.1mol/L的尿素用量大于6.0mL时，基本接近零级反应，此时，底物浓度对酶促反应无影响[4]。脲酶抑制剂乙酰氧肟酸、硼砂、邻苯二酚和氢醌对大豆脲酶和反刍动物瘤胃微生物脲酶有抑制作用。实验结果表明：不同脲酶抑制剂对脲酶的抑制作用不同。同种脲酶抑制剂对大豆脲酶和瘤胃微生物脲酶的抑制作用不同[15]。到目前为止，大量研究工作者研究的主要是大豆和土壤中的脲酶，而对萌发中的豌豆种子的脲酶研究甚少。因此，本课题的研究主要用于探求脲酶活性对豌豆的合理栽培是否有实际指导意义，为后期进一步的深入研究做铺垫。2.材料与方法2.1仪器和材料GR22G高速冷冻离心机（日本日立公司）；HH-4数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；SG2 pH计（梅特勒-托利多（上海）有限公司）。本实验所选豌豆为种子公司购买，品种包括秦选1号（硬荚）和豌杂1号（软荚）。药品：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、尿素、氯化汞。均为分析纯，且均为重庆北碚化学试剂厂生产。2.2实验试剂的配制磷酸盐缓冲液的配制：精密称取4.335g磷酸氢二钾溶于100mL水中，称取3.403g磷酸二氢钾溶于100mL水中，混合上述两溶液至1000mL容量瓶中，定容。调节此溶液pH至7.0（用同摩尔浓度的磷酸氢二钾溶液或磷酸二氢钾溶液调节）。精密称取60.000g尿素溶于上述磷酸盐缓冲液中，并调节pH至7.0，得1mol/L尿素磷酸盐缓冲液。分别取5、15、2