7第三章基因克隆载体2.pptVIP

可用外源DNA取代E1区。在可以表达E1的293细胞中复制。 E1为病毒DNA复制所必需。293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞 也可以利用E3区。主要用于基因治疗。 痘苗病毒（vaccinia virus）: 载体中含有痘苗病毒胸苷激酶TK基因和血凝素HA基因片段。 通过同源重组产生重组病毒。 杆状病毒表达体系 杆状病毒感染昆虫， 正常情况下感染昆虫细胞时，病毒颗粒被包裹在多面体中。 多面体是一种核内包含体，主要由多角体蛋白构成。 the baculovirus expression system. baculovirus infect insects. During normal infection of insect cells, virus particles are packaged within polyhedra, which are nuclear inclusion bodies composed mostly of the protein polyhedrin。 多角体蛋白在病毒感染循环的后期合成，充分表达时可以占到被感染细胞蛋白质总量的50%。 多角体为昆虫感染所需要，但感染培养细胞时并不需要。 所以多角体蛋白基因是一种非必需的基因，可以用其启动子驱动外源基因表达。 polyhedrin gene is an obvious candidate for construction of an expression vector, because it encodes a late-expressed dispensable protein that is synthesized in large amounts. 杆状病毒基因组为环状双链DNA分子，88 to 200 kb 。 不同杆状病毒的基因组大小也不同，它们的基因组太大，不能直接进行操作。 所以外源DNA的插入必须借助于转移载体 ? Baculovirus genome-----a circular double-stranded DNA molecule------transfer vector. 转移载体为大肠杆菌质粒，带有多角体蛋白基因启动子和其他基本的表达信号，两侧具有两段杆状病毒同源序列。 Transfer vectors are based on E. coli plasmids, and carry the promoter for the polyhedrin gene (or for another viral gene) and any other essential expression signals. 将目的基因连接到多角体蛋白基因启动子下游。 然后与杆状病毒DNA一起共转染昆虫细胞。 The cloned gene for expression is inserted into the transfer vector, and the recombinant is used to co-transfect insect cells with non-recombinant viral DNA. 病毒DNA与转移载体之间的同源重组可以产生重组的病毒DNA，可以选择出来用于目的蛋白的生产。 Homologous recombination between the viral DNA and the transfer vector results in the generation of recombinant viral genomes, which can be selected for and used to produce the protein of interest. 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcNPV 家蚕核型多角体病毒BmNPV 七、人造染色体 artificial chromosomes 基因组计划需要大容量载体来克隆大片段DNA。 vectors for cloning very large pieces of DNA used in large genome sequencing projects 啤酒酵母全序列测定采用粘粒基因组文库。 Saccharomyces cerevisiae，genomic library with cosmid vectors. 但对人类基因组计划，粘粒的容量太小。 Human Genome Project—HGP 1，YAC：Yeast artificial chromosome—插入片段不十分稳定。可达1000Kb. 目前容量最大的载体。重组子以染色体的方式在酵母细胞中保持下去。 着丝粒区