山生柳SSR-PCR反应体系优化.docVIP

  山生柳 SSR-PCR 反应体系优化# 郭敏，李毅，马彦军** （甘肃农业大学林学院，兰州 730070） 5 10 15 20 25 30 35 40 摘要：摘要 本实验以祁连山四个海拔梯度的山生柳为材料，采用 L9(34)正交实验设计和 单因子试验，研究了山生柳 SSR 技术中 PCR 体系的主要成分对扩增结果的影响，并对引物 SHUK123 的适宜退火温度进行优化，为 56。结果表明 PCR 反应体系的最佳条件为:20μL 2+ μL，20 ng/μL DNA 模板 1μL， 0.5μmol/L 的上下游引物各 2μL，10×Taq Buffer 2μL， ddH2O 加至 20μL。扩增反应程序为：94高温预变性时间 3min，94变性 45s，Tm(不同退 火温度)退火时间 45s，72延伸 30 s，循环数 30 个，最后 72后延伸时间 5min，4保温。 结果显示此反应体系在山生柳 PCR 扩增中的稳定性和可重复性较好。 关键词：山生柳；SSR-PCR；体系优化 Establishment and optimization of SSR-PCR System of Salix oritrepha Guo Min, Li Yi, Ma Yanjun (College of Gansu Agricultural University, LanZhou 730070) Abstract: In this paper, the SSR-PCR reaction system of four altitude of Salix oritrepha was optimized. In all the factors of each component changes caused by the effect of PCR - SSR, were studied by single factor and orthogonal design with different altitudes of Salix oritrepha. Meanwhile optimized primer SHUK123 of suitable annealing temperature was 56℃ .The results showed that polymerase chain reaction (PCR) system optimum condition for: 20 μL system , 1μL Mg2 + (2.50 m mol/L), 1.5μL dNTPs concentration (0.10 mmol/L), 1μL Taq polymerase (0.5 U), 1μL DNA template (20 ng/U L), 2μL each primer concentration (0.5μmol/L),2μL 10×Taq Buffer, then add ddH2O to 20μL . The PCR procedure was an initial step of 94℃for 3min, followed by 94℃for 45 s, annealing 45s (annealing temperature varies with the primers), 72 ℃ extension 30s, 30 cycles, final 72 ℃extension 5min,saving for 4℃.The optimized SSR-PCR system was stable and universality, The results indicated that the SSR reaction system would be more productive and repeatability with Salix oritrepha PCR reaction system. Keywords: Salix oritrepha; SSR-PCR; system optimization 0 引言 山生柳（Salix oritrepha）属杨柳科柳属多年生灌木。主要分布于海拔 3000~3700 米的高 山山脊、山坡[1]。是高寒灌丛群落的主要优势种之一， 常与秀线菊( Spiraea alpina ) 、金露 梅( Potentilla fruticosa )、沙棘( Hippophae rhamnoides )、甘肃杜鹃(Rhododendron potaninii )、 窄叶鲜卑花( Sibiraea angustata)、锦鸡儿(Caragana sinica ) 等组成高寒灌丛[2]。山生柳