染色质免疫共沉淀法对猪链球菌反应调控因子CovR靶基因的筛选.pdfVIP

· 680 · 医学研究生学报2013年7月 第26卷 第 7期 JMedPostgra，Vo1．26，No．7，July，2013 论 著 (基础研究) 染色质免疫共沉淀法对猪链球菌反应调控因子 CovR 靶基因的筛选 郭静静，王 玲，杜骁杰，李 敏，王 晶，李先富，郑 峰，胡 丹，王长军，潘秀珍 摘【要】 目的 猪链球菌CovR是具有全局调控作用的负反应调控因子。文章采用染色质免疫共沉淀(chromatinimmu— noprecipitation，ChIP)方法筛选转录调控因子CovR的靶基因，为进一步开展CovR调控机理研究提供条件。 方法 利用甲 醛固定猪链球菌2型05ZYH33菌株活细胞，超声波破碎法将DNA随机断裂成 100～500bp大小不同的片段 ，再利用CovR特 异性单抗免疫沉淀该蛋 白质一DNA片段解交联并分离纯化 DNA。针对 8个潜在的靶标基因启动子区设计引物 ，分别用设计的 引物对免疫共沉淀的DNA样品进行PCR扩增，验证CovR与DNA的结合。 结果 最佳ChIP实验条件为1％甲醛交联DNA 与蛋白质的复合物；功率80w、工作 10S、间隔30s、超声40次破碎该复合物，可得到 100～500bp大小不同的片段用于后续实 验。PCR结果显示 SSU1668基因和 SSU1732基因启动子区扩增 出阳性条带 ，另外 6种基因的启动子区未扩增出阳性条带。 结论 CovR抗体免疫沉淀得到的DNA片段中含有SSU1668基因和SSU1732基因启动子区，表明SSU1668基因和SSU1732基 因是 CovR的靶基 因。 【关键词】 猪链球菌2型；染色质免疫共沉淀技术；CovR；调控因子 【中图分类号】 R378．1 [文献标志码】 A [文章编号】 1008—8199(2013)07-0680-05 IdentificationofthetargetsofCovRbychromatinimmunoprecipitation GUOJing-jing，WANGLing，DUXiao-jie，LIMin，WANGJing，LIXian-fu，ZHANGFeng，HUDan，WANG Chang—jun，PANXiu—zhen ([nstituteofMilitaryMedicineofNanjingMilitaryRegion，Nanjing210002，Jiangsu，China) [Abstract] objective CovRplaysaveryimportantroleinregulatingtheexpressionofvindencefactorsandinducingthepatho— genicityofstreptococcussuis．Thisstudyaimedtofurtherinvestigatethereuglatingmechanism ofCovRusingchromatinimmunoprecipita— tiontoscreenandidentifythedownstream targetsofCovR． M ethods Livingcellsofstreptococcussuisserotype205ZY1-133werefixed withformaldehyde．sonicatedtosheartheDNA into100—500bpfragmentsandthenimmunoprecipitatedwiththeanti—CovR monoclonal antibody．TheDNA framg entswereextractedandpurified，nadtheprimersof8potentialtargetgenepromoterregionsweredesigned ． SpecificamplificationofDNA regionsbyeachprimersetwascheckedbyPCRreactionusingthepurifiedDNA asthetemplate． Results Theoptimalformaldehydeconcentrationtoachieveefficientandrev