生化分离技术沉淀技术.pptVIP

温度 样品浓度 溶液pH值 离子强度:离子强度低有利，0.01~0.05mol/L 金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+ 4、影响因素 三、选择性变性沉淀 利用蛋白质、酶、核酸等生物大分子对某种物理或化学因素的敏感性差异，实现分离。 选择性热变性（使用时需慎重！！！！） 加入表面活性剂 选择性酸碱变性 热变性沉淀（Thermal precipitation) 定义：利用在较高温度下，热稳定性差的蛋白质发生变性沉淀的现象，分离纯化热稳定性高的目标蛋白的方法。 操作条件： 调节pH； 加入有机溶剂。 特点： 是一种变性分离法，带有冒险性，需对目标蛋白和共存杂蛋白的热稳定性有充分了解。 加入离子型表面活性剂 十六烷基三甲基季铵盐的溴化物（CTAB） 主要用于沉淀酸性多糖 十二烷基磺酸钠（SDS） 主要用于沉淀膜蛋白和核蛋白 选择性酸碱变性 利用蛋白质和酶等在不同pH值条件下的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是在分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步骤。 四、等电点沉淀1、定义 利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法 原理： 蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。 2、等电点沉淀-沉淀条件 较低的溶液离子强度 溶液的pH值接近等电点 3、等电点沉淀-操作特点 无需脱盐 结合使用 调节方便 五、 有机（非离子型）聚合物沉淀法 某些聚合物，如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等，具有沉淀蛋白质的作用。其中最常用的是PEG，相对分子质量从200D到20KD的不同聚合程度的产品都是有效的，通常在蛋白质沉淀中使用PEG-6000或PEG-4000。 特点 优点： A、体系的温度只需控制在室温条件下； B、沉淀的颗粒往往比较大，产物比较容易收集； C、PEG非但不会使pro变性,而且可以提高它的稳定性； D、PEG无毒，优先使用在临床产品的加工过程中被。 缺点： A、PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去为此需用超滤和液-液萃取来解决； B、价格较昂贵。 六、聚电解质沉淀 聚电解质 沉淀机理：与絮凝类似，在蛋白质间起架桥作用，同时还兼有盐析作用。 应用：主要用于酶和食品蛋白的回收，常用的聚电解质有酸性多糖和羧甲基纤维素等。 七、高价金属离子沉淀 沉淀机理：可与蛋白质分子上的某些残基发生作用而使蛋白质沉淀。如Ca2+和Mg2+能与羧基结合，Mn2+和Zn2+能与羧基、含氮化合物以及杂环化合物结合。 优点：可使浓度很低的蛋白质沉淀；沉淀后金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。 沉淀工艺及操作 以盐析为例： （1）硫酸铵使用前的预处理：将硫酸铵配成浓溶液，然后通入H2S气体至饱和。放置过夜后用滤纸滤除重金属沉淀物，滤液在瓷蒸发皿中浓缩结晶，再在100℃下干燥即可使用。 （2）硫酸铵饱和度的调整：①当盐析要求饱和度高而又不宜增大溶液的体积时，可直接加入硫酸铵的固体盐，不同的饱和度应加入的硫酸铵用量可查附录一或二。②当盐析要求的饱和度不高，又必须防止局部浓度过高时，通常是采用加入饱和硫酸铵溶液法。 （3）盐析操作：计算好硫酸铵用量后，可对含蛋白的溶液进行盐析操作。一般是在搅拌的条件下，缓慢将所需的硫酸铵溶液或固体盐加入至待沉淀的溶液中。 （4）后处理操作：蛋白质经过盐析沉淀分离后，产品中夹带有盐分，需脱盐处理。比如食品工业用酶的法规，食品酶制剂中不允许混有多量的食盐以外的无机盐类。因此盐析得到的产品需通过脱盐方能获得较纯的产品。常用的脱盐处理方法有：透析法、电渗析法和葡聚糖凝胶过滤法。 第四章 沉淀技术 第一节 蛋白质沉淀的基本原理 第二节 蛋白质沉淀技术实施 学习目标 了解蛋白质的基本性质； 掌握蛋白质沉淀的基本原理； 掌握沉淀技术的基本方法； 能够正确进行蛋白质的沉淀分离操作，并能分析影响沉淀的有关因素。 沉淀的定义 沉淀技术是通过加入试剂或改变条件，使溶液中的溶质离开溶液生成不溶性颗粒而沉降析出的技术。 沉淀技术的特点及适用范围 优点：操作简便、生产所需的原材料易得、成本低廉，在产物浓度越高的溶液中收率越高，既可以用于实验室，也可以进行工业规模化生产。 缺点：产品质量较低，一般情况需要精制，过滤比较困难。 沉淀分离目前广泛应用于蛋白质等生物产物的分离。过程。 第一节 蛋白质沉淀的基本原理蛋白质表面特性－蛋白质组成 蛋白质组成 蛋白质折叠趋势 结果 在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区 影响蛋白质溶解度的主要因素 蛋白质性质的