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超声波破碎仪 四、?酶溶 破碎原理：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，增大胞内产物的通透性。 特点：不同的菌体细胞由于细胞壁化学组成不同应选用不同的酶处理。如溶菌酶适用于细菌；而酵母细胞的酶溶需用?-1,6-葡聚糖酶或甘露糖酶；破坏植物细胞则用纤维素酶。 自溶：是一种诱使细胞产生溶解自身的酶的特殊的酶溶法。 优点：①对设备的要求低，能耗小；②抽提的速率和收率高；③产品的完整性好；④对pH值和温度等外界条件要求低；⑤由于细胞壁被溶解，不残留碎片，有利于提纯。但是酶溶法受酶的费用限制。 五、化学破碎 又称化学渗透，是利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜结构，增大胞内物质的溶出速率；或者完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。 破碎原理：用酸碱、表面活性剂、螯合剂、有机溶剂或变性剂等处理细胞，增大细胞壁或细胞膜的通透性，或者降低胞内物质间相互作用，使目的产物易于释放。 六、其他方法 （1） 冻结－融化法 破碎原理：利用细胞在快速冷冻时，细胞内水很快结晶，形成大量晶核，体积增大，将细胞胀破 特点：此法主要适用于大肠杆菌和细胞壁较薄的细胞，特别适用于位于胞间质的酶的释放；操作方便，但耗时、耗能，大规模应用困难。 （2）干燥法 破碎原理：菌体细胞失水，细胞内盐分浓度增大，细胞渗透性发生变化，然后用丙酮，乙醇或缓冲溶液等溶剂抽提胞内物质。可分为：空气干燥（酵母菌）、真空干燥（细菌）、冷冻干燥（不稳定活性物质），和喷雾干燥。 （3）渗透压冲击法 ????? 破碎原理：细胞在高渗透压介质中平衡后，再突然将其转至低渗透压环境中，水会大量进入细胞，使细胞壁和膜胀破。 ??????? 特点：最温和的细胞破碎法；适用于易于破碎的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌。?????? （4）冷热交替法 将待破碎细胞在90℃维持数分钟，立即放入冰水浴使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。 A、细胞破碎仅发生在撞击的一瞬间，破碎程度均匀，避免反复和过度破碎； B、破碎的程度可无级调节，避免细胞内部结构的破坏，特别适合于细胞器的回收； C、实验室和工业规模均可应用，细胞浓度在10-20%，实验室规模的间歇处理能力在50-500 mL/h，工业规模的连续处理在 10,000 mL/h 以上。 （5） 撞击破碎法 操作：细胞喷雾高速冻结高速载气（300 m/s氮气流）将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板。 原理：细胞冷冻后成为刚性球体，降低破碎难度。 方法 技术 原理 效果 成本 举例 机 械 法 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器劈碎 适中 适中 动物组织及动物细胞 研磨法 细胞被研磨物磨碎 适中 便宜 超声波法 用超声波的空穴作用使细胞破碎 适中 昂贵 细胞悬浮液小规模处理 匀浆法（孔型） 须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎 剧烈 适中 细胞悬浮液大规模处理 珠磨破碎法 细胞被玻璃珠或铁珠捣碎 剧烈 便宜 细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理 细胞壁的破碎方法总结 方法 技术 原理 效果 成本 举例 化 学 法 酶消化法 细胞壁被消化，使细胞破碎 温和 昂贵 增溶法 表面活性剂溶解细胞壁 温和 适中 胆盐作用于大肠杆菌 脂溶法 有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳 适中 便宜 甲苯破碎酵母细胞 碱处理法 碱的皂化作用使细胞壁融解 剧烈 便宜 方法 技术 原理 效果 成本 举例 物 理 法 渗透冲击 渗透压破坏细胞 温和 便宜 血红细胞的破坏 反复冻融法 -15℃至-20℃冷冻，再室温下融化，膜的疏水键被破碎 温和 撞击破碎 干燥法 菌体细胞失水 剧烈 机械破碎法 优点：处理量大、破碎效率高、速度快，适用于工业规模的细胞破碎 缺点：A操作条件剧烈（高能、高温、高噪音、高剪切力，四高)，易使产品变性失活；易造成细胞过度破碎，不利于后续处理 B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难；C、细胞碎片大小不一，难分离 化学破碎法 优点：选择性高，胞内产物的总释放率低，料液粘度小，有利于后处理过程。 缺点：适用范围小，通用性差，费用高；破碎速度慢，处理时间长，破碎效率低，不适于大规模细胞破碎操作。引起新的污染。 机械破碎法VS化学破碎法 细胞破碎的评价 破碎率定义 N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通过直接计数和间接计数法得到。 直接计数法 方法：样本稀释 --- 染色 --- 上样 计数。 计算：同上。 优点：方法简单。 缺点： A、计数时间长，B、只有活细胞才被计数，误差大，C、细胞聚