生物化学（工科）蛋白质化学.pptVIP

2 ．特殊颜色反应― 蛋白质还具有氨基酸不具备的颜色反应 其中最典型的是蛋白质能发生特殊的双缩脉反应（biuret reaction）。双缩脲生成的反应为： 所以，在碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜结合，生成紫红色或红色物质，这一反应称为双缩脲两个或两个以上肽键结构的化合物都具有这个反应。 蛋白质中的肽键与双缩脲的部分结构相似，所以有同样的反应。因而双缩脉反应是肽键理论的依据之一。同时，双缩脲反应还可用于定性鉴定和定量测定蛋白质（比色波长为540nm ）。 第六节蛋白质及氨基酸的分离纯化与测定 一、分离纯化的一般原则及基本步骤 二、分离纯化的基本方法 三、氨基酸的分离 四、蛋白质及氨基酸的分析测定 一、分离纯化的一般原则及基本步骤 1 ．一般原则― 根据蛋白质的性质来设计分离纯化方法 2 ．基本步骤― 分离纯化的战略 1 ．一般原则― 根据蛋白质的性质来设计分离纯化方法 ① 分离纯化所用原料的来源要方便，成本要低；目的蛋白质含量、相对活性要高；可溶性和稳定性要好；基因分子背景如何，重组DNA 的表达系统、表达水平、表达方式都要明确。 ② 破碎细胞的条件要尽可能温和（使用极端条件要以目的蛋白质的活性和功能不受损害为原则）；尽可能多地去除各种杂质、脂类、核酸及毒素，双液相蛋白质萃取技术可同时去除这些杂质。 ③ 分离纯化的大部分操作是在溶液中进行的。操作缓冲液中物质成分要慎重考虑，避免随意性；还要考虑蛋白水解酶和核酸酶的抑制剂、抑制微生物生长的杀菌剂、蛋白质构象稳定剂和酶活性的还原剂及金属离子等。 ④ 建立灵敏、特异、精确的检测方法 2 ．基本步骤― 分离纯化的战略 （1）取材选取某种蛋白质含量丰富的材料，并要求便于提取。 （2）组织细胞破碎主要有机械法、物理法、化学法和酶法4 种。机械法是用组织分散器、匀浆器、细菌磨等进行破碎。物理法是应用超声波、渗透压、压榨等物理原理进行破碎；但超声波的空化作用易使酶等失活，因此超声波破碎时需加保护剂。化学法如碱性条件下处理对碱稳定的蛋白质或酶。酶法如使用溶菌酶、纤维素酶对细胞壁等进行破坏。在大规模生产时，渗透压休克法、细菌磨研磨和压榨法更适用。 （3）提取选用适当的溶剂进行提取。 2 ．基本步骤― 分离纯化的战略 （4）分离纯化根据待分离蛋白质的特异理化性质设计分离纯化方法。 （5）结晶分离提纯的蛋白质常要制成晶体，结晶也是进一步纯化的步骤。结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，可通过控制温度、加盐盐析、加有机溶剂或调节pH 值等方法来实现。 （6）鉴定、分析对所制得的蛋白质产品还需进行蛋白质的纯度、含量、相对分子质量等理化性质的鉴定和分析测定，主要方法有电泳法、色谱法、定氮法及分光光度法等。 二、分离纯化的基本方法 1 ．盐析与等电点沉淀― 根据溶解度不同的分离方法 2 ．离子交换色谱― 根据电荷性质不同的分离方法 3 ．凝胶过滤― 根据相对分子质量不同的分离方法 4 ．亲和色谱― 根据特异性亲和力不同的分离方法 5 ．高效液相色谱― 可用于分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、凝胶过滤 1 ．盐析与等电点沉淀― 根据溶解度不同的分离方法 （1）盐析大多数蛋白质是水溶性的，其溶解度与它们自身的理化性质、蛋白质的溶剂环境有关。高浓度的盐（常用中性盐硫酸按）可降低蛋白质的溶解度，这是因为高浓度的盐既争夺了蛋白质分子的水膜层，降低了环境中水的相对浓度，又中和了蛋白质表面的电荷。不同蛋白质因所带电荷和水化程度不同而在不同的盐浓度下分别沉淀析出，可达到分级分离的目的。 1 ．盐析与等电点沉淀― 根据溶解度不同的分离方法 （2）等电点沉淀由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间的静电斥力，因而容易聚集而沉淀，此时溶解度最小。当蛋白质混合物的pH 值被调到其中一种成分的等电点时，该蛋白质大部分或全部沉淀下来，其他等电点高于或低于该蛋白质等电点的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能再溶解。 2 ．离子交换色谱― 根据电荷性质不同的分离方法 离子交换色谱分离蛋白质是根据在一定pH 条件下蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维素（CM-纤维素）和弱碱型的二乙基氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素），前者为阳离子交换剂，后者为阴离子交换剂。还有改进型CM-Sephadex （葡聚糖凝胶）、DEAE-Sephadex等。蛋白质与离子交换剂的结合是靠相反电荷间的静电吸引，吸引力的大小与溶液的pH 值有关。常通过改变溶液中盐类离子强度和pH 值来完成蛋白质混合物的分离，结合力小的蛋白质先被洗脱出来。 3 ．凝胶过滤― 根据相对分子质量不同的分离方法 凝胶过滤又称为分子筛色谱（molicular