生物化学（工科）核酸化学.pptVIP

二、PCR 技术 PCR 技术是聚合酶链反应的简称。它是一种不需要借助于分子克隆就可以在体外快速繁殖和扩增DNA 的技术。其原理是应用与待扩增的目的DNA 片段两侧互补的引物，在DNA 聚合酶的作用下，引发目的DNA 片段的多次复制，从而使目的DNA 片段拷贝数迅速增加。PCR 的基本过程如图5-13 所示。 图5-13 PCR 的基本过程示意图 三、基因定点突变技术 基因定点突变技术是应用人工的方法，合成在某一点或某几点上碱基序列改变的突变DNA ，然后再通过突变DNA 的转录、翻译和表达，获得突变蛋白质（氨基酸序列在某一点或某几点发生改变）的技术。设计定点改变某一蛋白质氨基酸序列中的一个或儿个氨基酸，首先需要知道这个蛋白质的氨基酸序列、相应基因（DNA）的碱基序列以及分离纯化含有表达基因的质粒。例如要将某蛋白质中的一个Ser （编码为TCT ）换成Cys （编码为TGT ) ，需要将三联体编码中的C 改变成G 。基因定点突变技术的基本过程如图5-14 所示。 图5-14 基因定点突变技术的基本过程 三、基因定点突变技术 基因定点突变技术的关键是合成一种特殊的引物DNA 。这种引物DNA 的碱基序列除了在设计的突变位点处的碱基与模板DNA 不互补外，其余部分都与模板DNA 链（质粒中所含的能够表达成蛋白质的DNA 片段）互补「图5-14 ( a ) ］。先将分离纯化的质粒通过加热解链、降温复性后，引物DNA 与其中的一条单链（模板）互补结合。由于引物和模板之间只有一个碱基不互补，在适当的条件下（温度、离子强度等）不会影响它们之间的互补结合。然后在DNA 聚合酶和DNA 连接酶作用下进行引物延伸，得到一个双链新质粒分子「图5-14 (b) ］ 。再在此基础上进行复制，即可以得到两种子代质粒〔图5-14 (c)」：一种为原有的质粒（野生型，含有TCT 编码）；另一种为含有突变基因的质粒（突变型，含有TGT 编码）。这种突变基因最终可以表达并产生一种突变蛋白质，即在设计的位点上，Ser 被Cys 所取代的蛋白质。 四、定向分子进化 定向分子进化是应用现代生物技术手段，在分子水平上实践达尔文（Darwinian）的生物进化学说的新探索。主要是通过DNA 或RNA 的突变、筛选和扩增的不断循环，从而获得具有优良性能的新品种分子。应用定向分子进化技术获得某种具有特殊性能的RNA 分子的基本过程如图5-15 所示。先筛选出一种RNA 分子，它具有某些人们所希望的性质。再用一种特殊的RNA 复制酶― QβRNA 复制酶，在适当的条件下复制扩增。QβRNA 复制酶有一个特点，即它在催化复制过程中会出现许多的错误，这样就可以得到大量不同的突变RNA 分子。从这些突变分子中筛选出具有更好性能的突变分子，经过再扩增、再筛选、再扩增，最后可获得目标RNA 新品种。现在，已经将PCR 技术、核酸的逆转录技术等应用于定向分子进化研究中，从而使这一技术更加完善。 1 ．定磷法、定糖法― 测定核酸含量 (1)定磷法由于核酸含有磷酸基，且纯的核酸含磷元素的量为9.5 ％左右，故可通过测定磷的量来测定核酸含量。其主要步骤是：先将核酸样品用强酸（如浓硫酸、过氯酸等）消化成无机磷酸；然后，磷酸与定磷试剂中的钼酸铵反应生成磷钼酸铵，它在还原剂作用下被还原成钼蓝复合物；最后在650-660nm下比色测定，得出总含磷量（核酸磷加上无机磷）再减去无机磷（即不经消化直接测定）的量即为核酸磷的真实含量。此值乘以系数10.5 （即100 / 9.5 ）即为核酸含量。定磷法的适用范围为10-100 μg 核酸。 1 ．定磷法、定糖法― 测定核酸含量 (2)定糖法核酸分子含有核糖或脱氧核糖，这两种糖具有特殊的呈色反应，据此可进行核酸的定量测定。① RNA 在浓盐酸或浓硫酸作用下，RNA 受热发生降解，生成的核糖进而脱水转化成糠醛，糠醛与3 , 5 一二羟甲苯（苔黑酚或地衣酚）反应生成绿色物质，最后在670 -680nm 下比色测定。有关反应为： ② DNA DNA 受热酸解释放出脱氧核糖，后者在浓硫酸或冰醋酸存在下可与二苯胺反应生成蓝色物质，在595-620nm 波长下进行比色测定。化学反应为： ③ 定糖法的测定范围苔黑酚法为20-250μgRNA ，二苯胺法为40-400 μ gDNA 。在此范围内吸光度与核酸浓度成正比。 2 ．凝胶电泳― DNA 纯度鉴定 (1)紫外吸收法测核酸纯度通常利用测定260nm 处和280nm 处吸光度比值来确定。纯DNA 的A260 ／ A280为1.8 ，纯RNA 的A260 ／ A280为2.0 。囚此，在纯化DNA 时，通常用A260 ／ A280=1.8-2.0 作为纯度标准，若大于此值，表示有RNA