生化分离技术电泳技术.pptVIP

* 1．琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶： 由琼脂经过反复洗涤除去含硫酸根的多糖之后制成的，将它加入一定缓冲液中，加热溶解，冷却后则成胶，叫琼脂糖凝胶。 其分子结构大部分由1,3连接的β-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水α-D吡喃半乳糖交替形成的 约可区分相差100bp的DNA片段.其分辨率比聚丙烯酰胺凝胶低，但制备容易，分离范围广，主要用于分离、鉴定和纯化DNA片段。 其优点如下： 琼脂糖凝胶孔径较大，可以分析百万道尔顿分子量的大分子 机械强度高：可以在浓度1%以下使用；制成干膜可长期保存。 染色、脱色程序简单，便于定量测定。电泳速度快，背景色较低； 无毒；热可逆性；生物中性：不与生物材料结合； 电内渗大：对于对流电泳有益 结构均匀，含水量大（约占98%~99%），近似自由电泳，但对样品吸附极微，电泳图谱清晰 利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA主要包括制胶、加样、电泳、染色和检出五个步骤。 1．制胶 称取琼脂糖粉末，以pH8.0的乙酸钠-Tris缓冲液配成1%溶液。 将制胶模具垂直放置，周围用硅油（或其他密封物质）密封，或用夹子夹紧，以免胶液泄漏。溶液从顶部灌注。灌胶完成后从顶部插入梳子，以形成加样孔。 室温下放置1-2小时，待胶柱呈灰白色半透明状态则表明已聚合完毕。 2．加样 加样前轻轻将梳子倾斜拔出，防止气泡陷入，用电极缓冲液淋洗加样孔，吸出，再加适量电极缓冲液。 取0.5μg左右的样品，如为质粒DNA或它的EcoRI的酶解液，体积为50μL左右，加入1/4体积的溴酚蓝-甘油指示剂混合后，用微量注射器小心地将样品加成一细窄带，否则影响电泳分辨率。如果没有足够数目的样品，应在加样孔中加样品缓冲液，不要留有空孔，以防止电泳时邻近带的扩展。 3．电泳 先在电泳槽的下槽中装入电极缓冲液。将聚合后的凝胶连同模具一起移入电泳槽中，在上槽中注入电极缓冲液，开始电泳。待溴酚蓝前沿到达电泳槽底部（阳极时），切断电源，关掉冷却系统，取出凝胶，准备染色。 4、染色 用菲啶溴红染色液浸泡凝胶10分钟，然后倒出染色液，将凝胶移到磨砂玻璃上。 5．检出 将凝胶板置于紫外灯下，约3分钟后可见到胶板中呈现具有红色荧光的条带，该条带标志着DNA所在位置。 2、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）： 由丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成； 原理： 由于聚丙烯酰胺凝胶是多孔介质，不仅能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子的分离，具有分子筛效应。 在使用PAGE进行蛋白质分离时，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取决于蛋白质的尺寸和形状。 PAGE可以用圆盘电泳、垂直电泳或水平电泳 聚丙烯酰胺凝胶优点 ①样品不易扩散； ②可随意控制凝胶浓度，按需要制成不同孔径凝胶 ③把分子筛效应和电荷效应结合在同一方法中，能够达到更高的分辨能力； ④电泳时不产生电渗，化学上惰性较强； ⑤重复性较高； ⑥透明性好，机械强度好，有弹性； ⑦能按照需要把带有一定电荷的基团作为共聚体渗入其中； ⑧需要样品量少，1～100μg已足够； ⑨需要设备简单，时间短； ⑩用途广泛，对蛋白质、核酸等生物高分子可进行分离、定性、定量、小量制备、分子量测定等等。 PAGE的具体操作过程 制胶：确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓度和缓冲液），使用灌胶模具灌胶； 样品准备：选择合适的样品缓冲液、确定合适的样品浓度（1~2mg/L，考染），加样（溴酚蓝）； 电泳：4~6小时，待溴酚蓝前沿到达阳极底部； 检测：紫外扫描或染色（考马斯亮蓝R-250、银染色—灵敏度比考染高100倍、荧光探针）； 照相、凝胶干燥： 定量测定： 3．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白质分子量的测定； 特点：设备简单、操作简便、测定快速、重复性高、样品无需纯化。 SDS的原理 蛋白质分子的解聚 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。 蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变 未知蛋白质分子量的测定 基于上述SDS的原理介绍，我们可以利用SDS电泳进行未