壳聚糖-阿仑膦酸钠复合材料对大鼠成骨细胞增殖和分化影响的实验研究.pdfVIP

暨南大学硕士论文 中文摘要 【目的】 体外分离培养新生 SD 大鼠颅盖骨的成骨细胞，并对其进行形态学、生物学鉴 定。构建阿仑膦酸钠(ALN)与壳聚糖(Cs)物质的量之比分别为1:5、1:10、1:20 的三种壳聚 糖-阿仑膦酸钠(Cs/ALN)复合材料，观察其生物相容性，并初步研究三种 Cs/ALN 复合材 料对成骨细胞增殖与分化的影响。 【方法】 用酶消化法分离培养新生 SD 大鼠颅盖骨的成骨细胞，并进行体外传代培养。 倒置相差显微镜及HE 染色法观察成骨细胞的形态；利用MTT 比色试验绘制P3 、P4 代 成骨细胞的增殖曲线；碱性磷酸酶(ALP)染色法检测成骨细胞内ALP 的含量；茜素红染色 法及Von kossa 染色法观察成骨细胞于体外培养时形成的矿化结节。制备ALN 与Cs 物质 的量之比分别为1:5、1:10、1:20 的三种Cs/ALN 复合材料，同时制备不含ALN 的Cs 支 架材料。将P3 代SD 大鼠成骨细胞与上述4 种材料复合培养一段时间后，扫描电镜观察 细胞在材料表面的黏附及生长情况；MTT 比色试验评价材料对成骨细胞增殖的影响； Transwell 法观察材料对细胞的趋化作用；流式细胞术检测材料对细胞生长周期的影响； 酶标仪法、ELISA 法分别检测细胞培养上清液中 ALP 及骨钙素(BGP)的含量，以初步了 解材料对细胞分化的影响。 【结果】 本实验采用酶消化法成功分离并培养出纯度较高的SD 大鼠成骨细胞；MTT 比 色试验显示细胞增殖能力强，扩增迅速；ALP 染色可观察到成骨细胞内含有大量的ALP 颗粒，说明细胞的分泌功能强；培养2 周后，茜素红染色法及Von kossa 染色法可观察到 大量钙化结节的形成。将细胞与四种支架材料复合培养一段时间后，扫描电镜观察及MTT 比色试验均证实四种材料都具有良好的生物相容性；MTT 比色试验及流式细胞术细胞周 期检测结果显示物质的量之比ALN: Cs=1 :10 的Cs/ALN 复合材料对成骨细胞增殖的促进 作用最强；细胞培养上清液ALP 及BGP 含的测定显示物质的量之比ALN: Cs=1 :10 的 Cs/ALN 复合材料对成骨细胞分化的促进作用亦最强；ALN: Cs 为1:5 和1:20 的两种 Cs/ALN 复合材料对成骨细胞的增殖和分化也有一定的促进作用；而Cs 支架材料则对成 骨细胞的增殖和分化无明显的促进作用；Transwell 试验结果显示，ALN: Cs=1 :5 的Cs/ALN 复合材料对成骨细胞的趋化作用最强。 【结论】 本实验成功从新出生的SD 大鼠颅盖骨中分离出成骨细胞，经反复贴壁法纯化 后细胞纯度较高，且体外培养时扩增迅速，形态学及生物学特性稳定。Cs/ALN 复合材料 是一种具有良好生物相容性的新型复合生物支架材料，除了具备传统的骨组织工程支架材 I 暨南大学硕士论文 料的特性外，物质的量之比ALN: Cs=1 :10 的Cs/ALN 复合材料具有明显促进成骨细胞增 殖、分化及一定的趋化的作用，为将药物负载在组织工程生物支架材料中，以达到大幅度 提高体内成骨效率、修复骨缺损的目的提供了初步的理论依据。 【关键词】SD 大鼠，成骨细胞，壳聚糖，阿仑膦酸钠，复合材料，骨组织工程。 II 暨南大学硕士论文 Abstract 【Objective 】 To isolate and culture of neonate SD rats skull osteoblasts in vitro, and then identify their morphological and biological characteristic. Make three kinds of chitosan/alendronate composite