禽流感H9亚型一步法RT-PCR快速检测试剂盒的研制及应用.pdfVIP

中国畜牧兽医 年第卷第期 生物技术 禽流感亚型一步法?快速检测试剂盒 的研制及应用 程福亮,梁瑾,范群平,陈甜甜,宿志瑞,聂兆晶,谷巍 山东宝来利来生物工程股份有限公司,山东泰安 摘要:为建立一种简单、快速、灵敏、准确的禽流感检测方法,本研究根据中收录的禽流感病毒高度保守 的基因序列,设计对的特异性引物,建立了一步法快速检测禽流感的,对反应条件进行优化后,组装成快速检测试 剂盒,并对临床收集的疑似禽流感病料进行检测。结果显示,试验成功建立了禽流感病毒一步法?检测方法,在此 基础上完成了试剂盒的组装,对份疑似禽流感病料的检出率高达%以上,检测灵敏度达’。。,稳定性良好,冷冻 保存期达个月。经证实该试剂盒具有操作简便、经济、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点,值得推广 应用。 关键词:禽流感; ?;试剂盒 中图分类号:. 文献标识码: 文章编号:??? ,为单 因序列,既简化了操作步骤,又能快速定型。在中 禽流感病毒 国,目前危害严重的主要是、亚型的,急 股负链,由个独立的节段组成? 需快速、准确而简便的定型方法。 等,,其显著的生物学特征之一是亚型众 本研究根据中的基因保守 多,变异频繁。不同亚型毒株对宿主的致病力差异 序列设计对引物,建立了快速检测的? 显著,亚型为中低致病力毒株,特点是分布广 扩增系统,并在此基础上,进行阳性对照的建 泛,能造成宿主的免疫抑制,并且可与其他病原微生 立、组装,研制出禽流感一步法检测试 物通过协同作用引起禽类发病。虽然为中等 剂盒,应用此体系检测临床感染样品。拟研制一种 低致病力毒株,但它对养禽业的危害同样不容忽视, 经济、快速、准确的禽流感?检测试剂盒,旨 年,中国亚型禽流感的发病率占 在为中国禽流感的血清学和流行病学调查提供一种 禽流感总发病率的.%,成为影响中国养禽业 良好的检测试剂盒。 的主要亚型等,;唐秀英等,。 材料与方法 由于亚型引起鸡的轻微呼吸道症状、 .材料 产蛋鸡产蛋量下降等,与新城疫、传染性喉气管炎、 ..病料与标准毒株临床分离疑似禽流 传染性支气管炎等禽类疾病极为相似,在临床上较 感病料若干,包括用于试验研究和后期成品试剂盒 难区分。常规的检测包括病原的分离鉴定、琼脂扩 临床病料对比验证所用;标准毒株由山东宝来 散试验、血凝和血凝抑制试验、免疫荧光法和 利来生物工程股份有限公司研究院保存。 等常规方法发挥了重要作用包红梅等, .. 菌种与鸡胚 转化用大肠杆菌感受 。但这些方法操作比较繁琐,费时、费力,也不 态细胞购自大连宝生物工程公司;日龄鸡胚购自 适用于早期诊断黄淑坚等,。分子生物学的 山东济南家禽研究所。 发展为快速而准确地对检测和分型鉴定创造 . 方法 了条件,如?及核酸探针等检测技术,但它 .. 引物设计参照国标 ?禽 们主要针对单基因检测,常需要进行多次试验才能 流感诊断技术中介绍的引物进行引物设计,引物序 定型。而多重?方法,以多对引物在同一 列为::,? 反应体系中扩增出同一病毒不同的特异性基 一 ,?:一 ,预期扩增的目的片段大小为 。引物由上 修回日期:? 海博亚公司合成。 作者简介:程福亮一,男,山东人,兽医师,硕士,主要从事 兽医微生物及免疫学的研究。 ..病毒扩增 将病料处理后,接种于 万方数据生物技术 中国畜牧兽医 年第卷第期 日龄鸡胚,~ 后收集死亡鸡胚的尿囊 的目的条带图。 液,并测定其血凝价和对鸡胚的半数致死量。 ..病毒的提取按照 说明书 提取 ,用水溶解。 ..一步法按下列组成配制一步法 ≯鞫一案鬟鞲糕圜 反应液表。反应程序:℃反转录 。 ;..㈡” ;℃预变性 ;℃变性 ,℃退 警圈 火 ,个循环;℃延伸 ,℃延伸 。?产物置℃保存。 图 禽流感病毒//基因的产物鉴定电泳图 注:为阴性对照;为禽流感标准株基因的?扩增 表禽流感亚型一步法体系 结果;~为个病料的?产物;为 试剂 剂量“ 。 无菌酶灭菌超纯水 .一步法反转录试验结果 将鸡胚收集的尿囊 . / 液进行禽流感基因一步法试验,然后 / 进行琼脂糖凝胶电泳,结果显示在 处出现明 反转录酶 显的目的条带,与预期结果相相符图。 酶 上游引物 下游引物 模板 总计 .. 禽流感基因的克隆及产物的序列 融.一.期■’嘲劳袖?■ 测定分析利用大连宝生物公司的回收试剂 一 盒,从琼脂糖凝胶中回收产物克隆到? 醚鏊 载体中。转化大肠杆菌感受态细胞,挑选阳 图禽流感病毒基因的一步法结果 性克隆,送上海联合基因公司完成序列测定。 注:为 ;为禽流感标准株扩 ..禽流感基因一步法检测试剂 增结果;、为个病料的产物;为阴性对照。 盒的组装试剂盒分为盒和盒,其中盒中含 .禽流感基因重组质粒的结果在完 有溶液、溶液和阳性对照,溶液:反转录 成基因的连接转化后,每个板挑个单菌落加入含 酶、抑