利用杆状病毒系统获得携带抗体表达基因的双链AAV的研究.pdfVIP

浙江理工大学学报，第30卷，第6期，2013年11月 of Sci—Tech Journal Zhejiang University V01．30，No．6，Nov．2013 文章编号：1673—3851(2013)06—0870—07 利用杆状病毒系统获得携带抗体表达基因的 双链AAV的研究 刘海燕1，钱其军h2 (1．浙江理工大学生命科学学院新元医学与生物技术研究所，杭州310018； 2．第二军医大学东方肝胆外科医院病毒基因治疗实验室，上海200438) 摘要：研究使用二杆状病毒一昆虫细胞系统获得携带抗体表达基因的8型双链腺相关病毒(scAAV)。首先利 ng／mL。该 白印迹法检测出阿瓦斯汀(Avastin)重轻链已成功表达，ELISA检测出Avastin在体外的表达量可达770 研究表明利用杆状病毒系统所获得8型scAAV具有生物学活性并能实现外源基因的体外表达。 关键词：杆状病毒；双链AAV；病毒生产；外源 中图分类号：Q782 文献标志码：A 0 引 言 细胞为主邸]，想要获得足够的病毒就需要大量的细 肿瘤治疗中化疗和放射性疗法仍是目前使用最 胞及转染质粒，昂贵的生产成本以及低效的生产过 广泛的治疗方法，但是此方法的毒副作用较大，患者 程成为大量获得AAV的一大难题。而杆状病毒系 易对使用的药物产生抗性或者治疗后仍有肿瘤细胞 统具有高安全性、操作简单快捷、成本低、易于大规 的残留，不能达到理想的治疗效果。随着基因工程 模培养等优势[7]，进而受到越来越多研究者的青睐。 技术及DNA重组技术的崛起，腺相关病毒(AAV)目前采用质粒共转染HEK293细胞获得携带 在肿瘤治疗中已经显示出良好的前景。 治疗基因的双链AAV[4]和采用二杆状病毒系统获 得表达抗体的单链AAV[83的研究均有报道，但采用 腺相关病毒(AAV)是除腺病毒和逆转录病毒 外另一种常见的病毒载体，在基因治疗中发挥着重 二杆状病毒系统获得表达抗体的双链AAV的相关 要的作用。虽然rAAV已在工期和Ⅱ期临床试验研究尚无报道，因此笔者对此展开研究，检测采用二 中应用，但所用的AAV多为单链DNA，需要一个杆状病毒系统获得表达抗体的双链AAV的可 由单链转变为双链的过程，影响了AAV表达的速 行性。 度与效率。自身互补AAV(scAAV)无需合成互补 1 实验 链DNA，越过了第二链合成的障碍，与传统的单链 AAV相比具有更高的转导效率[1]。研究表明，1．1材料与仪器 scAAV比传统的AAV载体至少能提高20倍的转 导效率‘zs|。 收稿日期：2013一03—12 基金项目：国家自然科学基金(8107185) 作者简介：刘海燕(1985一)，女，山东威海人，硕士研究生，主要从事肿瘤的基因一病毒治疗研究。 通信作者：钱其军，E-mail：qianqi@163．com 万方数据 第6期 刘海燕等：利用杆状病毒系统获得携带抗体表达基因的双链AAv的研究 871 细胞、sf900ⅡInsectMedia、CeUfectin⑩ⅡReagent ladder 购自Invitrogen公司；限制性内切酶、DNA Ez TGTGCGGCCGC。 mix购自NEB公司；SYBR⑩Pr卯咒izTa口1MⅡ DNABloodMiniKit 1．2．2 购自TaKaRa公司；QiAamp