抗重组人红细胞生成素(rhEPO)多克隆抗体的制备及其亲合常数.pdfVIP

广西师范大学学报(自然科学版) 2003年 10月 JOURNALOFGUANGXINORMAL.UNIVERSITY Vol.21 No.4 抗重组人红细胞生成素(rhEPO)多克隆抗体的制备 及其亲合常数(Kaff)的测定 闰 珑,毖捷波 ，郭振泉，常文保. 北〔京大学 化学与分子工程学院 北京 100871) 人促红细胞生成素(EPO)是由肾脏分泌的一种单链酸性糖蛋白.相对分子质量为34OOOD.蛋白质部 分由165个氨基酸组成，糖部分由三条天门冬氨酸N末端糖链和一条丝氨酸0末端糖链构成.其主要生 理功能是刺激骨髓红细胞的生成与释放 促进血液中红细胞数量增多，提高血液的载氧能力.目前.通过基 因重组技术获得的rhEPO已作为生物药品被广泛应用于临床治疗中.同时由于其 “兴奋剂”的作用，也被 国际奥委会列为禁用药物.抗重组人促红细胞生成素(rhEPO)多克隆抗体((pAb)的制备对EPO作用机制 的研究和临床应用有重要的意义，是实现对其定量检测的物质基础 我们采用rhEPO抗原直接免疫家兔 的方法获得了含有rhEPO多克隆抗体的动物血清.经测定抗血清效价为10-s，抗血清经纯化后，采用系列 稀释固定化抗原与抗体的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法测定了抗体与固定化抗原作用的亲合常数 (K ). 动物免疫 取青紫兰家兔 1只，将。.75mg的rhEPO与弗氏完全佐剂等体积混合后((1.0MI)注射家兔左右脚 掌各。.5ml，进行基础免疫.加强免疫分别在基础免疫 10d,20d,30d,40d后进行.前三次加强免疫每次 注射含0.5mgrhEPO与等体积弗氏不完全佐剂的乳化液(1.0mL)，免疫部位分别为淋巴结、背部脊椎。 两侧多点和肩脾、腿脾骨两侧.最后一次直接进行静脉加强免疫，注射rhEPO0.2mg(0.2ml). 2 血清效价的测定 最后一次免疫7d后，取耳血.经ELISA方法测定抗血清的效价为 10-;.放血，共获得抗血清60mL. 分装保存于一200C CAb为原始抗血清浓度，包被抗原浓度为 10m刃I. 3 亲合常数(K}fr)的测定 抗血清采用改进的辛酸饱和硫酸钱方法u:纯化后，经uv测定抗体浓度为16g/I.抗体与抗原的亲 合常数可以通过系列稀释固定化抗原和抗体的ELISA方法测定川. 基金项 目 国家自然科学基金资助项目( 作者简介:常文保 (1939-)，男，教授.研究方向:生化分析.E-mail:changwb@chem.pku.edu 第 21卷 广西师范大学学报 (自然科学版) 0 才 ， J 飞 /一\\、 e s j / e s e s 0 6 ， / . 舒 · 自06 时 0o4 吐 .\ 川 0 0 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1g1/叼 1(C江 图1 抗血清效价测定曲线 图2 固定化抗原与抗体系列稀释曲线 初始抗体浓度ccid)为16创L,固定化抗原浓度 2倍递减 K,值可通过如下公式计算: K,,t一(。一1)/2(n[Ab」一[Ab])， 式中，n=[Ag],/仁Ag]，其中A〔g工。和A〔g]，为酶标板上每孔的固定化抗原浓度，八〔b]，和 A〔b],为相应 固定化抗原浓度时最大吸光度值一半((O.D.-5。和O.D.-50)时所对应的可测量抗体浓度.经计算表 观K,;值为2.3X10L/ml,.