人乳铁蛋白肽的分子改良及在大肠杆菌中的表达研究.pdfVIP

2011，v0I．28No．10亿 学与生 物 Z程 Chem istry Bioengineering doi：10．3969／j．issn．1672—5425．2011．10．007 人乳铁蛋 白肽 的分子改 良及在大肠杆菌中的表达研究 蔡 岫，叶 江 ，张惠展 (华东理工大学 生物反应器工程 国家重点实验 室，上海 200237) 摘 要 ：采用 s0E—PCR技术 ，设计合成 hLF18-40的编码基因；以融合表达策略构建了pET-43．1a-hLF18-40表达质 粒 ，并获得较高的可溶融合蛋 白表达 ；将融合蛋 白Nus—hLF18-40进行 Ni 柱亲和层析、除盐、浓缩后 ，用肠激酶切割释 放抗茵肽 hLF18-40，为今后基 因工程法表达人乳铁蛋 白肽提供 了依据。同时，将 hLF18-40的C末端氨基酸遂一缩短直 至 hLF18-32，用化 学法合 成 hLF18-40、hLF18-39、hLF18—38、hLF18-37、hLF18-36、hLFI8-35、hLF18-34、hLF18-33和 hLF18-32等 9条肽 ，采用肉汤微量稀释法分别测定其最小抑菌浓度 (MIC)，结果发现 ：hLF18—40的MIC为 40 mo1． L～ ，hLF18—39的 MIC略微 下降 (2O～40 “mol·L )，hLF18-35的 MIC与 hLF18—40的相 同。 关键词 ：人乳铁蛋 白肽；融合表达；纯化 ；C端缩短；抗茵活性 ’ 中图分类号 ：Q 78 文献标识码 ：A 文章编号 ：1672—5425(2011)10—0028—04 当前 ，由于抗生素 的滥用而造成细菌耐药性 的形 作者在此采用大肠杆菌系统表达人乳铁蛋 白肽 ， 成使细菌性感染和疾病呈上升趋势。在寻求新型抗菌 以期实现其高效表达 ；同时对人乳铁蛋白肽 hLF18—40 策略的研究中，抗菌肽因其非特异性的作用方式 ，使病 的抑菌活性进行研究 ，以期寻找具有抗菌活性的最短 原微生物对其不能产生抗性 ，优势逐渐显现。其 中乳 抗菌肽。 铁蛋 白肽不含稀有氨基酸及外源化学成分，安全、健 l 实验 康 ，具有替代抗生素的巨大潜在优势口]。 乳铁蛋白肽是乳铁蛋白在酸性环境下经 胃蛋 白酶 1．1 材料 水解，从其 N端解离 出的一段多肽 ，具有广谱 的抑菌 革兰 氏 阴性 菌 EscherichiacoliATCC25922、 和杀菌能力 ，能抑制真菌和病毒的增殖、抑杀癌细胞 EscherichiacoliJM83、EscherichiacoliBL21(DE3) 等 ¨2]。hLF18-40是 人 乳 铁 蛋 白肽 (Humanlacto- 均为 自行保 存。酵母粉 等 LB 培 养基成 分购 自 ferrin)N端 18～4O位氨基酸组成的抗菌肽，其氨基酸 UNIPATH公司，MH 肉汤培养基购 自青岛高科 园海 序列 为：TKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR，具 有 博生物技术有 限公司。质粒抽提等试剂盒购 自捷瑞公 抗贾第虫及抑制 白色念珠菌 的活性，对包括氟康唑和 司 。 二性霉素B抗性分离菌株在 内的所有念珠菌属菌株 1．2 引物 的设计 都有抗性。hLF18—40对 白色念珠菌的最小抑菌浓度 选用 pET一43．1a(+)和 pET一41b(+)质粒作为表 (MIC)为 18．7z／mol·L ；且在高盐浓度 (60mmol· 达载体构建表达盒。设计引物时，根