DEK蛋白的真核表达纯化及其活性检测.pdfVIP

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology，2011，31(12)：1—9 ， + ‘—‘+一’+‘ ”+ ‘+‘ ’+‘ ‘+ + x j研究报告 i k ． ． + ．．+ ．．+ ．．+ ．．+ ．．+ ．．+ ．．+ - DEK蛋 白的真核表达纯化及其活性检测术 郭海红 杨 辛 郭 芳 胡红月0 (北京交通大学理学院生命科学与生物工程研究院 北京 100044) 摘要 利用Bac—to-Bac杆状病毒表达系统表达DEK蛋 白并进行纯化。首先以pFastBacI质粒构 建重组质粒pFastBacI—DEK，转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid．DEK，通过脂质 体介导转染 Sf9细胞产生具有强感染力的重组杆状病毒 AcNPV—DEK。用此重组杆状病毒 AcNPV—DEK感染Sf9细胞表达His-DEK融合蛋 白。在非变性条件下，利用Ni—NTAagarose对表 达的His．DEK融合蛋 白进行纯化，经SDS．PAGE和Westernblotting分析，在50kDa处出现特异性 蛋白条带并证实其为His—DEK融合蛋 白。凝胶迁移阻滞实验表明，融合蛋 白His．DEK与DNA的 结合具有结构特异性，其与超螺旋型DNA结合活性强于与线性化DNA的结合活性。真核表达并 纯化的融合蛋 白His—DEK与 DNA的结合活性要明显强于原核表达的融合蛋 白His—CDB。DEK 蛋白的磷酸化修饰会阻碍其与DNA的结合，而Sf9细胞 中表达的融合蛋 白His．DEK存在磷酸化 修饰，将His．DEK去磷酸化后，其与DNA的结合活性有所提高。 关键词 DEK蛋 白 杆状病毒表达系统 凝胶迁移阻滞 中图分类号 Q819 DEK蛋白是一种含量丰富的染色质架构蛋 白¨4。。 恶性肿瘤的发生发展密切相关，因此对 DEK蛋 白的 人类的DEK蛋 白最初发现于一种急性髓系白血病 功能进行研究是非常必要的，这将有助于揭示癌症的 中 。这种急性髓系白血病的亚型以 (6；9)(p23； 发病机理，为治疗癌症提供新的检测、诊断和治疗 q34)染色体的易位为特征，导致 DEK的编码区与核孔 方法。 蛋白NUP214的编码区融合，最终以DEK—CAN融合蛋 本研究的主要 目的是构建表达全长DEK的质粒 白的形式被释放出来。随后，DEK蛋白被确认为幼年 载体，采用杆状病毒真核表达系统表达纯化出具有生 类风湿关节炎 ]、系统性红斑狼疮 等几种 自身免 物学活性 的 DEK蛋 白，并检测其与 DNA的结合 疫疾病的自身抗原。 活性 。 随着研究的深入，DEK蛋白在细胞中的作用 日益 1 材料与方法 受到关注。很多研 究显示，DEK蛋 白在 DNA 的复 制 、损伤修复 、基因的转录调控 ”圳 、mRNA的转 1．1 材 料 录后加工 蚴 以及细胞分化 中起重要的作用。但 1．1．1 菌株、质粒和细胞 含 DEK蛋白全长基因的 是，DEK蛋白的作用机理尚有待进一步研究。另外， 重组质粒 pMD18-T—DEK为本实验室制备并已鉴定正 DEK蛋白与细胞凋亡密切相关 ]，DEK蛋 白对细胞 确；pcDNA3．1(一)、E．coliDH5ot、E．coliDH10Bac、Sf9为 凋亡具有双重性，即促进或抑制细胞凋亡。 本实验室保存；pFastBacI、Cellfeetin@IIReagent、SF-900 目前 ，DEK蛋 白已被确认为是一种癌基因，其与 IISFM培养基为 Invitrogen公司产品，His-CDB融合蛋 白为本实验室原核表达纯化并复性 。。。 收稿 日期：2011-08-22 修回日期：2011-10．11