Thermal Shift Assays在重组森林脑炎病毒丝氨酸蛋白酶纯化中的应用.pdf

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology，2009，29(11)：53～59 ThermalShiftAssays在重组森林脑炎 病毒丝氨酸蛋 白酶纯化 中的应用 术 朱俊萍 范东瀛 (首都医科大学基础医学院 北京 100069) 摘要 应用ThermalShiftAssays技术，高通量优化了重组森林脑炎病毒丝氨酸蛋 白酶纯化过程中 所使用的缓冲液中盐的种类和 pH，显著改善了该重组蛋 白在纯化过程 中出现可溶性聚集体的现 象。最终获得的重组蛋 白质单体量 由原先的75％提高到99％以上，极大提高了该纯化蛋 白质的 均一性和质量 ，为后续的蛋 白质结晶研究奠定 了基础 。 关键词 ThermalShiftAssays 重组森林脑炎病毒丝氨酸蛋 白酶 纯化 中图分类号 Q789 在蛋 白质研究 ，如蛋 白质药物、蛋 白质结构的研究 过对体系中蛋白质溶解曲线的检测，实现对上述的蛋 中都无法回避蛋白质生产工艺中面临的各种挑战。作 白质及其稳定性相关 因子 的快速高通量筛选与检 为生物活性大分子的蛋 白质对所处环境条件非常敏 测 ’。ThemralShiftAssays在蛋 白质药物研发、结构 感，容易发生降解、聚集等不利状况。高产量高质量的 生物学研究、蛋 白质基 因工程等多领域 中的应用 日益 稳定蛋 白质产品是蛋 白质研究的一贯需求。在蛋 白质 拓宽和深入 。 的聚集行为中，聚合率 以及最终的聚集状态除与蛋 白 本研究展示了ThemralShiftAssays在快速优化无 质 自身的相对热动力学稳定性有关外，还强烈依赖于 活性的重组森林脑炎病毒 (tick—borneencephalitisvirus， 蛋 白质所处的溶液环境，如温度、pH、盐的类型和浓度、 TBEV)丝氨酸蛋白酶NS2B／3的纯化缓冲液体系、提高 促溶物、防腐剂 以及表面活性剂等 ’。 该纯化蛋 白质均一性中得到成功的应用。 ThermalShiftAssays是近年新发展起来 的一种基 1 材料与方法 于荧光技术的实验检测方法。其检测原理是利用对环 境变化敏感的荧光染料 ，如 SyproOrange来监测体系中 1．1 材料与试剂 蛋白质的热稳定性 以及可能影响蛋 白质热稳定性 的相 以 pET11d为载 体 (Novagen)在 BL21(DE3) 关因子，如缓冲液、添加剂 以及蛋 白质配基等。该技术 (Novagen)宿主菌中表达 c末端带 His一tag的无活性 将 SyproOrange染料的高度敏感性、SyproOrange可反 TBEV重组丝氨酸蛋 白酶 NS2B／NS3一S135A(下简称无 映蛋白质结构伸展、折叠状态的特性以及可以在小体 活性NS2B／3)。该重组蛋白C端为TBEV非结构蛋 白 积中反应和检测等特性 与 目前商品化的可实施高通 NS3N端 1～190个氨基酸组成的丝氨酸蛋 白酶结构 量操作并可以进行荧光信号检测的rea1．timePCR仪相 域，重组蛋白N端为 NS3的辅助因子TBEV非结构蛋 结合，发展了ThemralShiftAssays技术。该技术可 以通 白NS2B中46～94位氨基酸的亲水中心活性区域，这 两部分以9个氨基酸的柔性链相连。c末端连接6个 收稿 日期：2009-07-08 修回日期 ：2009-09-09 京市属高等学校人才强教计划资助 组氨酸的标签以便于纯化。突变NS3蛋白酶结构域中 电子信箱：jpzhu0217@vip．sina．corn 第 135位的丝氨酸为缬氨酸，以破坏蛋 白酶的活性位 54