棘腹蛙非伤害性取样DNA提取及16S rRNA基因序列特征分析.pdfVIP

《黑龙江畜牧兽医》科技版 2011年12月(上)4l 棘腹蝰菲伢害II取样DNAI提取及 I _ 6Sr_RNA基圄廖刻特徭 析 徐敬明 (重庆文理学院生命科学与技术学院，重庆402168) 中图分类号：$865．1 文献标识码 ：B 文章编号：10047-7034(2011)12—0041—03 关键词：棘腹蛙；非伤害性取样 ；DNA提取；PCR扩增；16SrRNA基因；系统发生 摘 要：为了改变将两栖类动物处死后从肌 肉提取DNA的传统取样方法，试验采用非伤害性取样方 法分别从棘腹蛙蹼和趾提取DNA，并以肌肉为对照进行PCR扩增比较。结果表明：蹼和趾的扩增效 果与肌 肉相当，均能满足获得高质量DNA的试验需求。试验测定了四面山和酉阳棘腹蛙群体的 16S rRNA基因部分片段的序列，长度均为530bp，膘嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T)、乌嘌呤(G)、胞嘧啶 (C)的 含量相近，分别为30．2％、22．8％、21．5％、25．5％，30．4％、22．8％、21．5％、25．3％，2个序列间有 6 个变异位点，核苷酸差异率为1．13％，其中转换5个、颠换 1个，转换与颠换比值为5．0。基于已知的 棘腹蛙所有 16SrRNA基因5llbp同源序列，获得的系统发生树的拓扑结构表明，各群体间遗传分化 程度表现为与其分布的地理区域的，临近关系及是否存在地理隔离相对应。 棘腹蛙属两栖纲无尾 目蛙科…，是我国特有的 目前，对各种动物DNA的提取研究较多_3 ，对 珍稀两栖类动物，营养价值和经济价值极高，是名贵 两栖类动物 DNA提取的研究也有一些报道，如王宇 的营养滋补食品。目前，保护遗传学与分子生态学方 等_8采用非伤害性取样研究了虎纹蛙血液和趾的 面的研究已成为现代生物学研究的热点，作为其研究 DNA提取。试验旨在探讨棘腹蛙非伤害性取样DNA 基础的DNA质量成为影响试验结果的一个重要因 提取的可行性，并对肌肉、蹼、趾线粒体 16SrRNA基 素。常用的获得DNA取样方法有3种：伤害性取样、 因进行PER扩增和序列测定，结合从 GenBank上下 非伤害性取样和非损伤性取样 J。伤害性取样是指 载的有关棘腹蛙的基因序列进行分子系统关系分析， 通过获得研究对象的新鲜肌肉、肝脏等组织提取 探讨棘腹蛙不同地理种群的遗传分化，为珍稀两栖类 DNA，此取样方式对于物种的破坏性较大，特别是对 动物的分子遗传学研究特别是繁殖遗传学研究提供 于珍稀濒危物种而言，其破坏是毁灭性的。非伤害性 可持续的DNA来源和技术方法支撑 J。 取样主要通过采集动物毛发、羽毛、耳、尾、趾或抽取 1 材料 动物的血液等来提取DNA。非损伤性取样是在不触 试验用棘腹蛙于2010年 5月份采 自重庆江津四 及或不伤害动物本身的前提下，通过收集脱落的毛发 面山和酉阳，于 一40℃冰箱中冷藏，备用。每种取 或羽毛、粪便、尿液、食物残渣等样品进行遗传分析的 3个个体用于序列分析。 取样方法，该方法不会对动物本身产生伤害，但却很 2 方法 难获得完整的DNA。 2．1 DNA提取 无尾两栖类动物作为生态系统中的重要组成部 试剂盒(E．Z．N．A．”SQTissueDNAKit)，Ome— 分，却因生活环境的丧失、环境的污染、过度的捕猎等 gaBio—tekIne．公司生产，应用蛋 白酶K提取法提取 使其种群数量急剧减少。一直以来，对于无尾两栖类 DNA。取四面 山和酉 阳棘腹蛙各 3只，分别取约 动物遗传多样性等方面的研究多采用伤害性取样，不