牛GM-CSF与金黄色葡萄球菌黏附素FnBPB共表达质粒的构建与原核表达.pdfVIP

动物医学进展 ，2011，32(10)：79—82 ProgressinVeterinaryM edicine 牛 GM—CSF与金黄色葡萄球菌黏 附素 FnBPB共表达质粒的构建与原核表达 范 鑫 ，郝永清 ，张爱荣，陈晓杰 (内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018) 摘 要：采用 PCR方法对牛粒细胞一巨噬细胞集落刺激 因子 (GM—CSF)和金黄色葡萄球菌 FnBPB的D 区进行特异性的扩增 ，并通过重叠延伸 PCR扩增GM-CSF-FnBPB串联基因，构建了克隆质粒 pMD19-GM- CSF．FnBPB。利用表达载体 pET一32a(+)对该融合基 因片段进行原核表达 ，SDS—PAGE分析表 明，在 l mmol／LIPTG诱导浓度下，在 39ku处 出现了与 目的蛋 白一致的外源蛋 白带，Westernblot分析表明，该蛋 白具有反应原性 ，进而证明该融合基 因成功在原核细胞 中表达。 关键词 ：金黄色葡萄球菌；粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子 ；纤连素结合蛋 白B；重叠延伸PCR克隆；原 核表达 中图分类号：Q786 文献标识码 ：A 文章编号：1007—5038(2011)10—0079—04 奶牛乳腺炎 (COWmastiffs)主要是 由病原微生 CD的数量和功能来增强免疫应答强度[8]。CSF能 物感染而引起乳房组织及乳头发炎 的一种疾病 ，其 刺激骨髓多能干细胞增殖 ，使之向中性粒细胞 (pol— 中金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)是最 ymorphonuclear，PMN)、巨噬细胞和肥大细胞系列 常见和最重要的乳腺炎致病菌[1]。在 S．aureus感 分化。有研究报道 ，乳腺 内注射 CSF，能增强乳 中 染的早期 ，黏 附素是最重要 的致病 因子[2]。所 以阻 PMN合成过氧化物的能力，提高吞噬细菌的百分 断 S。aureus感染的初始阶段 ，特别是阻止细菌黏 附 率 。 到细胞和定殖在黏膜表面 ，可能是预 防感染最有效 因此 ，本研究拟在金黄色葡萄球菌黏 附素免疫 的策略[3]。 原性和黏附素抗体免疫保护作用等研究的基础上 ， 黏附素(adhesins)又称为微生物表面识别黏附 根据金黄色葡萄球菌的致病机理和奶牛乳房的抗菌 基质成份分子 (microbialsurfacecomponentsrecog— 防御机制 ，利用细胞 因子 GM—CSF的生物学特性， nizing adhesivematrixmolecules，MSCRAMM s)， 与奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌纤连素结合蛋 白Fn- 是金黄色葡萄球菌表面表达的一些特异性蛋 白，它 BPB构建共表达质粒，为研制预防和治疗奶牛金黄 能促进与宿主细胞、细胞外基质和可溶的血浆蛋 白 色葡萄球菌乳房炎的基因疫苗奠定基础。 的黏附L4]。这些与细胞壁结合 的蛋白质包括 2个凝 1 材料与方法 集因子 ClfA 和 ClfB(clumpingfactorA andB)、2 1．1 材料 个纤连素结合蛋 白FnBPA 和 FnBPB(fibronectin- 金黄色葡萄球菌由内蒙古农业大学兽医学院微 bindingproteinsAandB)，胶原连接蛋白Can(col- lagen-bindingprotein，Can)和 蛋 白 A (protein 生物研究室保存 ；克隆载体 pMD19一TSimple载体、 A)[5]。大量研究证实 ，纤连素结合蛋 白(fibronec- dNTP、限制性 内切酶均为宝生物工程 (大连)有限公 tin-bindingproteins，FnBPs)是重要的毒力 因子[6]。 司产品；E．coliTOP10、