EttanDIGEImager检测荧光蛋白印迹系统的多重荧光信号.pdfVIP

采用 Ettan DIGE Imager检测荧光蛋白印迹系统的多重荧光信号 J. Goscinski and I. Gottschalk GE Healthcare, Uppsala, Sweden 技 术 TM TM Ettan DIGE Imager 和 ECL Plex 系统完全兼容，在灵 封闭后，把蛋白膜用“兔抗人”转铁蛋白 (D a k o 革 敏度、线性和动态范围上和TyphoonTM 扫描仪达到了相 Cytomation)和“鼠抗牛”肌动蛋白(Sigma-Algrich)一 同水平。在多重荧光应用上这两种扫描仪也有相似的 抗混合物 (用PBST稀释到1:750)室温孵育1.5 小时。用 新 结果，同一次蛋白印迹实验中检测两种蛋白时，抗体或 PBST 洗涤后，把蛋白膜放在 ECL Plex Cy5 偶联的羊抗 者染料间的交叉反应降到最低。 兔IgG 和 ECL Plex Cy3 偶联的羊抗鼠 IgG (都用PBST 稀 讲 导言 释到1:2500)二抗混合物中，在侧摆摇床上室温蔽光孵 育1 小时。 坛 TM ECL Plex 多重荧光蛋白印迹系统基于CyDye 偶联抗体 的灵敏度，能够高线性地在皮克 (10-12 克)范围进行检 然后把蛋白膜在 Ettan DIGE Imager 和Typhoon 多功能 扫描仪上扫描，使用Cy3和Cy5适合的波长和滤光器用 测，动态范围几乎达到4 个量级 (1，2)。多重荧光检测 Typhoon 一次扫描。分析两种CyDye 偶联抗体的检测 采 是ECL Plex系统另一个重要特点，能够同时检测两种蛋 用 极限和交叉反应。 白质。 多重荧光应用 在ECL Plex 试验中，数据的质量不仅仅取决于印迹，还 要看所用的成像系统。现在，一种新的扫描 CCD 成像 TGF- 是一种有效的生长因子，可以刺激多种细胞效 系统，Ettan DIGE Image 问世了。这是一款专门为双向 应，如生长抑制、细胞分化和凋亡。这里用TGF- 活化 荧光差异凝胶电泳 (2-D DIGE)和 ECL Plex 系统而开发 人类T293 肾上皮细胞，并在不同时间点收获细胞。准 的成像系统，能够生成CyTM 2-，Cy3- ，和Cy5 标记的凝 备这些细胞的裂解液，凝胶电涌分离，转印到Hybond 胶和蛋白印迹的多通道图像。 ECL 和Hybond-LFP 膜上，然后按照前述步骤进行抗体 检 杂交，靶蛋白是p38 的磷酸化构型 (pp38)，它是一个介 测 本研究比较了两种检测ECL Plex系统的扫描仪Typhoon 导TGF-活化功能的低丰度蛋白。一抗是抗肌动蛋白的 荧 和新的Ettan DIGE Imager。在多重荧光分