柔嫩艾美耳球虫二氢乳清酸脱氢酶基因注释、克隆与原核表达.pdfVIP

动物医学进展。2013，34(7)：35—38 in Medicine ProgressVeterinary 柔嫩艾美耳球虫二氢乳清酸脱氢酶基因注释、克隆与原核表达 陈 佳1’2，戚南山2，廖申权2，吴彩艳2，吕敏娜2，李娟2，吴玄光H，孙铭飞2+ (1．华南农业大学兽医学院，广东广州510640；2．广东省农业科学院动物卫生研究所，广东广州510640) 摘 要：二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)是催化嘧啶从头合成途径中的关键酶，由于顶复门原虫等低等生 物与其宿主的DHODH在分子结构上的差异，可以作为研发新型抗顶复门原虫药物的靶标而成为研究的热 点。本研究利用电子克隆策略，以疟原虫DHODH氨基酸基因序列为信息探针，搜索球虫基因库(www． sanger．ae．uk／projects／E—tenella／)，拼接注释了柔嫩艾关耳球虫(Eimeria ORF基因序列。 构建重组表达载体pCold 1 254 bp，SDS鉴定结果表明，目的蛋白约45 立以EtDHODH为靶点的抗球虫药物筛选奠定了基础。 关键词：柔嫩艾美耳球虫；二氢乳清酸脱氢酶；电子克隆；原核表达 中图分类号：S852．723；Q785 文献标识码：A 鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生肠道引起的一种 研究证实在临床使用多年的风湿治疗药物——来氟 危害严重的寄生虫病。柔嫩艾美耳球虫(Eimeria米特的作用靶标就是人的DHODH[7]。近年来，以 DHODH为靶标，筛选出了一系列 tenella)是鸡的一种最常见、致病性最强、危害最为P．falciparum 严重的球虫，寄生在小肠绒毛上皮和盲肠的黏膜下， 具有抗疟原虫活性的先导化合物[6]，已经显现出以 引起出血性肠炎，可导致死亡，特别对雏鸡危害最 DHODH作为药物靶标研制、筛选治疗性药物的可 大[1]。目前控制球虫病的主要方法是化学药物防行性。 治，但随着抗药虫株的不断出现，寻求新的抗球虫药 目前尚未见柔嫩艾美耳球虫DHODH的相关 物势在必行心J。 报道，本文以E．tenella为研究对象，通过电子克隆 嘧啶核苷酸是生物机体生存所必需的，机体获 策略注释DHODH基因序列，并进行克隆以及重组 取嘧啶核苷酸的途径有头合成途径和补救途径[3]。 表达，为进一步研究E．tenella HODH)的功能，以及以其为靶标筛选新型抗球虫 研究表明顶复门原虫类的恶性疟原虫(Plasmodium 药物奠定基础。 falciparum)只能利用嘧啶从头合成途径获取嘧啶 gon- 1材料与方法 以及嘧啶核苷酸[4]。而在弓形虫(Toxoplasma dii)嘧啶从头合成途径对其感染致病起到不可替代1．1材料 的作用[5]。目前虽无同属于顶复门原虫的E．tenel-1．1．1 实验动物 1日龄岭南黄肉鸡，购自广东省 zn嘧啶核苷酸合成的相关研究，但本课题组根据相 农科院畜牧研究所；102全价肉仔鸡饲料(不含任何 关基因注释结果，证明E．tenella的嘧啶从头合成途 抗球虫药和抗菌药)，广东省农科院畜牧研究所饲料 径也是不可或缺的(未发表资料)。二氢乳清酸脱氢 厂特制。 dehydrogenase，DHODH)是一1．1．2 E．tenella广东株、E． 酶(dihydroorotate 虫株、菌株和载体 Rosseta 种含铁的依赖黄素单核苷酸(FMN)的蛋白酶，参与coli I和E．coli