反转录巢式多重聚合酶链式反应体系检测单细胞中时钟基因表达.pdfVIP

2011正 6月 首 都 医 科 大 学 学 报 Jun．2011 第 32卷 第3期 JournalofCapitalMedicalUniversity Vo1．32 No．3 [doi：10．3969／j．issn．1006-7795．2011．03．011] · 基 础 研 究 · 反转录巢式多重聚合酶链式反应体系检测单细胞中 时钟基因表达 袁艳鹏 关云谦 林庆玲 薛金花 蔡彦宁 (1．首都医科大学宣武医院神经生物学研究室 ，北京 100053；2．首都医科大学宣武医院细胞治疗室， 教育部神经变性病重点实验室，北京 100053) 【摘要】 目的 建立一种高度灵敏的能够在单细胞水平检测时钟基因表达的反转录巢式多重聚合酶链式反应(multiplexnested reversetranscription—polymerasechainreaction，multiplexnestedRT—PCR)体系。方法 选取核心时钟基因bmall，clock，perl，per2， cryl和cry2，以及看家基因 一actin，分别设计和优化巢式引物对。以基因质粒为模板 ，检测巢式多重 PCR体系的灵敏度。体外转 录得到各个基因的RNA模板 ，并检测反转录巢式多重 PCR体系的灵敏度。使用手动微操作器，显微镜下负压获取悬浮单个 NIH／3T3细胞 ，使用反转录巢式多重PCR体系检测其中目的时钟基 因。应用实时定量PCR检测整体水平时钟基因表达情况， 与单细胞水平进行比较。结果 巢式多重PCR检测体系可以检测出单拷贝质粒DNA。反转录巢式多重PCR能够检测出4拷贝 RNA模板。利用上述体系发现，NIH／3T3单细胞 中时钟基因环路表达存在很大差异，同时发现群体水平perl和per2表达的高峰 和低谷间差异有统计学意义，而单细胞水平per1表达则差异无统计学意义。结论 建立了高度灵敏的用于检测时钟基因表达的 反转录巢式多重PCR体系，揭示了单细胞水平时钟基因表达的异质性 ，也验证了整体水平与单细胞水平时钟基因表达的差异。 【关键词】 反转录巢式多重聚合酶链式反应；时钟基因；单细胞；NIH／3T3 【中图分类号】 R74 Analysisofkey clock genesexpression in individualcellswith multiplex nested reversetranscriptase·PCR YUANYan—peng，GUANYun—qian，LINQing—ling，XUEJin—hua，CAIYan—ning (1．DepartmentofNeurobiology，XuanwuHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100053，China；2．Celltherapycentre，Xuanwu Hospital，CapitalMedicalUniversity，KeyLaboratoryforNeurodegenerativeDiseasesofMinistryofEducation，Bejiing100053，China) 【Abstract】 Objective Toestablishahighlysensitivemultiplexnestedreversetranscriptasepolymerasechainreaction(RT—PCR) systemforanalysisofkeyclockgenesexpressioninindividualcells．Methods Sixkeyclockgenes(bmall，clock，perl，per2，cryl， cry2)andahousekeepinggene(p—actin)werechosenandthenestedprimerpairsweredesignedusingOligo6．0primeranalysissoftware． SensitivityofrmultiplexnestedPCRandRT．PCRwasexaminedseparately．Andthentheexpressionprofilesofclockgenewereexamined insinglecellscollectedwith