哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆的免疫保护作用.pdfVIP

第 27卷第 2期 大 连 海 洋 大 学 学 报 Vol_27No．2 2012年 4月 J0URNAL0FDALIAN OCEANUNIVERSITY Aor．20 12 文章编号：2095—1388(2012)02—0137—06 哈维氏弧菌硫氧还蛋 白还原酶在大肠杆菌中的 表达及对大菱鲆的免疫保护作用 陶然 ，刘瑞 ，王晴 ，陈吉祥 (1．中国海洋大学 海洋生命学院，山东 青岛266003；2．兰州理工大学石油化工学院，甘肃 兰州 730050) 摘要 ：从致病性哈维氏弧菌 Vibdo^口nl SF1基因组中扩增获得含硫氧还蛋白还原酶 (trxR)基因的1133 bp目的片段，连接至载体 pMD19一TSimple。测序结果表明，目的片段含有 960bptrxR基因阅读框，编码为 319个氨基酸残基的蛋白质。Blast分析结果显示，硫氧还蛋白还原酶蛋白氨基酸序列与哈维氏弧菌、溶藻 胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、弗 氏弧菌的硫氧还蛋白还原酶蛋 白序列的相似性分别为99％、98％、 96％、94％、92％。构建表达质粒pET一28a(+)／rr】(R后转化至大肠杆菌EcoliBL21(DE3)中，用 IPTG 诱导表达 ，SDS分析显示，重组蛋白的相对分子质量为34000。用 Ni琼脂糖亲和层析柱分离得到纯 化的重组蛋白，将该蛋白以5O 尾的剂量肌肉注射免疫大菱鲆Scophthalmusmaximus，用EHSA法检测免 疫 1～4周内鱼血清中特异性抗体的效价。结果表明，特异性抗体效价持续升高，第2周则达到 1：128。免 疫4周后用哈维氏弧菌 SF1对大菱鲆进行人工感染 ，对照组鱼 的死亡率为 100％，免疫组鱼的死亡率为 25％，相对免疫保护力为75％。试验表明，哈维氏弧菌TrxR蛋 白具有较好的免疫原性，可作为潜在的亚 单位疫苗用于哈维氏弧菌病的免疫预防。 关键词：哈维氏弧菌；硫氧还蛋白还原酶；克隆；大菱鲆；免疫原性 中图分类号：$941 文献标志码：A 哈维氏弧菌Vibrioharveyi是一种革兰氏阴性的 损害。硫氧还蛋 白系统包括硫氧还蛋白、硫氧还蛋 细菌，广泛分布于海洋环境及海洋生物中…，能引 白还原酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NAD— 起海水鱼类及其它养殖动物发病，是世界上许多国 PH)，是一个NADPH依赖性的二硫化物还原酶系 家和地区养殖对虾和鱼类的致病菌 J，也是中国 统，广泛存在于真核生物和原核生物 中 HJ。硫 海产经济鱼类弧菌病的主要病原菌之一，该致病菌 氧还蛋白系统与体内细胞的氧化还原反应、核酸代 给海水养殖业造成了巨大的经济损失 。哈维 氏 谢和细胞生长密切相关。硫氧还蛋 白还原酶 (thi— 弧菌的胞外蛋 白酶、磷脂酶、溶血素、Ⅲ型分泌系 oredoxinreductase，TrxR)是一种 NADPH依赖性 统、密度感应系统等与其致病性密切相关 J。 目 的包含 FAD结构域的二聚体硒酶，主要功能是催 前，国内对细菌病防治仍然主要依靠化学药物及抗 化NADPH将小分子蛋 白硫氧还蛋 白上的二硫键 生素，由此带来的环境污染、药物残留及细菌耐药 (一S—S)还原成 (一SH)：的反应，维持 trx的还原 性现象 日趋严重 。免疫预防技术既安全又无污染， 型，可以维持细胞 自由基的产生和被清除之间的平 是水产养殖病害防控最为有效的措施之一。关于对 衡，对微生物在不 良环境中的生存及病原菌的致病 哈维氏弧菌全菌灭活疫苗的研究已有成功的报道 ， 作用有重要作用 ¨ 。 哈维氏弧菌的溶血素、胞外蛋白酶、外膜蛋 白等也