哈维氏弧菌铁超氧化物歧化酶基因表达及免疫作用研究.pdfVIP

第36卷 第2期 水 生 生 物 学 报 Vo1．36．NO．2 2012年 3月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA M ar．， 2012 DOI：10．3724／SP．J．1035．2012．00212 哈维氏弧菌铁超氧化物歧化酶基因表达及免疫作用研究 辛瑞晓 易 飞 张 蕊 徐 涛 玄 璞 刘 瑞 贾俊涛2 陈吉祥 (1．中国海洋大学，海洋生物遗传学与基因资源利用教育部重点实验室，青岛 266003； 2．山东出入境检验检疫局，青岛 266002) 摘要：哈维氏弧菌(Hbrioharveyi)是鱼虾等海水动物的重要病原菌 。超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase) 通过催化超氧阴离子 自由基 (O )形成O2和H2O2，以保持细胞 自由基产生和清除之间的平衡，在病原菌适应 环境及细菌致病性方面发挥重要作用。用 PCR从哈维氏弧菌基因组扩增得到600bp的 目的片段，序列分析 表明与弧菌Fe．SOD的序列相似性为91％一99％。将 目的基因片段克隆到原核表达载体进行表达。SDS．PAGE 电泳分析显示纯化的蛋 白为单一条带，分子量为27kD。具有典型的Fe．SOD吸收光谱，对氯仿．乙醇和 H2O2 敏感，表明纯化的蛋 白属于Fe．SOD。用邻苯三酚 自氧化法测得酶的最适 pH7，最适温度 20~C。该酶在 pH 6—8的范围内稳定，当温度超过 40~C时酶的活力迅速丧失。纯化的重组蛋白免疫大菱鲆，4周后用致病性哈 维氏弧菌进行人工感染试验，对大菱鲆的免疫保护率为 80．00％。Westernblot可以检测到免疫大菱鲆的血清 中的特异抗体。 关键词：哈维氏弧菌；超氧化物歧化酶；基因；表达；性质；免疫原性 中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：1000-3207(2012)02—0212．08 微生物在紫外辐射、温度变化、渗透压改变、 变株在有氧环境中生长缓慢，对百草枯的抵抗力降 氧化等环境应激过程中常常遇到环境中较多超氧阴 低，绿脓菌素生产能力降低1【；新生隐球菌(Crypto— 离子 自由基(0 )、过氧化氢(H2O2)、羟 自由基(OH)· COCCHSneoformans)SOD基因突变株荧光素酶、尿酶 等的损害，在应激状态下细胞 自身代谢产生的自由 和磷脂酶活力明显降低 】。 基增加[1】，较多的自由基引起细胞毒性作用，如细 哈维 氏弧菌是一种革兰氏阴性海洋细菌，是海 胞膜损坏、蛋白质变性 、酶失活、DNA链断裂 、染 水养殖鱼类和对虾 的条件性致病菌l9]。已知哈维氏 色体畸变等 2【】。生物在进化过程 中形成了有效 的抗 弧菌的胞外蛋 白酶、磷酯酶、溶血素等与致病性密 自由基防御体系l3，钔，包括酶和非酶抗氧化系统，酶 切相关，Zhang，eta1．对不同来源的哈维氏弧菌致病 抗氧化系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽 性及其胞外产物毒性进行研究，发现致病性强的菌 过氧化物酶(GSH．Px)、过氧化氢酶(CAT)等5【]。超氧 株溶血性和其他胞外产物毒性都很强，部分强致病 化 物 歧 化酶 (Superoxidedismutase，简称 SOD， 性哈维氏弧菌中有两个溶血素编码基因[101。哈维氏 EC．1．15．1．1)通过催化超氧阴离子形成 O2和 H2O2 弧菌的密度感应系统可 以调控细菌的发光 、III型分 清除 0一，从而保持 ROS产生和清除之间的平衡，在 泌系统、铁载体、多糖的产生，与致病性密切相关I】】。 微生物适应环境及细菌致病性方面发挥重要作用6『】。 但哈维氏弧菌的致病机理尚未完全清楚。本文从哈 铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)Fe．SOD 突 维氏弧菌基因组DNA克隆Fe—SOD基因