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一 38一 江苏农业科学 2011年第 39卷第4期 刘文倩，王 猛，张奕强，等．C型口蹄疫结构蛋白VP3的原核表达及生物活性[J]．江苏农业科学，2011，39(4)：38—40 C型 口蹄疫结构蛋 白VP3的原核表达及生物活性 刘文倩 ，王 猛 ，张奕强 ，刘永生 ，张 杰 (1．中国农业科学院兰州兽医研究所／家畜疫病病原生物学国家重点实验室／农业部畜禽病毒学重点开放实验室／ 农业部兽医公共卫生重点开放实验室，甘肃兰州 730046；2．四川农业大学动物生物技术中心，四川雅安625014) 摘要：利用PCR扩增技术，以本实验室构建的c型口蹄疫pMD—P1重组质粒为模板扩增C型日蹄疫 VP3片段， 并连接到原核表达载体pGEX一6P一1上，构建阳性质粒 pGEX—VP3并转化人大肠杆菌 BI21(DE3)中。使用不同 IPTG浓度进行诱导，收集菌液进行 SDS—PAGE。使用 Model422Electro—Eluter切胶 回收 目的蛋 白，并进行 Western— Blotting分析。结果得到5Oku左右 目的条带，证实融合蛋白VP3大肠杆菌中得到以包涵体形式表达，且使用切胶回 收后的蛋 白能被 C型 口蹄疫阳性血清识别，具有 良好的反应原性。 关键词：C型口蹄疫；结构蛋白VP3；原核表达；生物活性 中图分类号：S856．2 文献标志码 ：A 文章编号：1002—1302(2011)04—0038一o2 口蹄疫(footandmouthdisease，FMD)是一种 由口蹄疫病 限公司；dNTP、 DNA聚合酶购 自Fermentas公司；辣根过 毒 (FMDvirus，FMDV)引起的危害牛羊等偶蹄动物的严重的 氧化物酶标记兔抗豚鼠IgG购 自Sigma公司；豚鼠c型FMDV 急性热性高度接触性传染病。由于其传播速度快，不易控制 阳性血清由笔者所在实验室制备并保存。其他试剂均为分析 和消灭，严重危害世界动物贸易，被世界卫生组织列为必须上 纯。蛋 白切胶 回收仪 器 Model422Electro—Eluter为 报传染病之一 。口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科 (Pj— Bio—Bad公司产品。 cornaviridas)中的口蹄疫病毒属 (Aphthavirus)。所含核酸为 1．3 PCR引物 RNA，全长8．5kb。成熟病毒粒子约含30％的RNA，其余 参照基因库 已发表的 C型 口蹄疫病毒基因序列，用 70％为蛋白质。结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4形成五聚体单 Oligo5．0软件设计了1对 目的片段包含 VP3基因在内的特异 位构成病毒衣壳。其 中，VP1、VP2、VP3位于病毒衣壳表面， 性 弓J物，即 VP3(+)：5 一GC GAATrCGGAATC1’I1℃一 VP4位于病毒内部。口蹄疫病毒VP3上包括了B—Bknob在 CCGTCGCGTGC一3(EcoRI)(29bp)；VP3(一)：5 一GC 内的多个抗原位点，并且与其他小RNA病毒一样，VP3是结 CTCGAGTYGTYGTCTAGCGACCACCG一3(XhoI)(28bp)。 构蛋 白中结构最为保守的 ，因此可以作为疫苗及建立诊断 上下游引物 5端分别加入 EcoRI和XhoI酶切位点。引物 方法的基点。口蹄疫共 7个血清型，包括 0、A、C、AsiaI(亚 由Invitrogen公司合成。 洲 I型)及 SATI、SATII、SATⅢ(南非 I、Ⅱ、Ⅲ型)。C型 1．4 FMDVVP3基 因的克隆 口蹄疫虽流行范围比较小，但是在我 国周边亚洲地 区及非洲 以pMD—P1为模板 ，常规 PCR扩增 VP3片段，反应条 仍见流行报道 ，因此对 C型口蹄疫疫苗及诊断方法的研 件 ：94℃预变性 8min；94℃变性 1min，58℃退火 1min， 究对于防止c型口蹄疫传人我国具有重要意义。本研究使 72℃延伸 1min，循环35次；72℃延伸 10vain。PCR产物用 用大肠杆菌表达系统对 FMDVVP3片段成功实现表达，为C 1．5％琼脂糖凝胶电泳检测。 型 口蹄疫的疫苗及诊