H9N2亚型禽流感病毒的纯化及间接ELISA方法的建立.pdfVIP

一 264一 江苏农业科学 2011年第 39卷第 4期 牛圆圆，李 银 ，刘字卓，等．HgN2亚型禽流感病毒的纯化及间接 EL／SA方法的建立[J]．江苏农业科学，2011，39(4)：264—266 H9N2亚型禽流感病毒的纯化及间接 E[JSA方法的建立 牛因囡 ，李 银 ，刘宇卓。，刘 飞 ，叶焕春 ，李祥瑞 (1．江苏省农业科学院兽医研究所 ／农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室／国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014； 2．南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095) 摘要：将H9N2亚型禽流感病毒 株病毒液经过红细胞吸附释放法纯化后作为 ELISA包被抗原 ，建立 H9N2亚 型禽流感抗体间接ELISA方法。试验结果表明，该方法具有敏感性高、特异性好的优点，为快速检测禽流感抗体提供 了便利途径。 关键词：H9N2亚型禽流感；间接ELISA；抗体；红细胞吸附释放法 中图分类号：$852．65 文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2011)04—0264—03 禽流感 (avianinfluenza，AI)是由正黏病毒科流感病毒属 制备阴性血清。随机挑选 4只6周龄的小鼠进行免疫，首次免 A型流感病毒引起的一种禽类疾病综合征。该病以引起禽类 疫采用完全弗氏佐剂与等体积病毒液乳化液，抗原量为 的呼吸系统 以及全身性败血症为特征，高致病性禽流感 0．8mI／只；二次免疫采用弗氏不完全佐剂与等体积病毒液乳 (hilypathogenicavianinfluenza，HPAI)被世界动物卫生组织 化液，抗原量为 1mL／只；三次免疫直接使用病毒液，抗原量为 列为A类传染病 ，我国也把禽流感列为一类动物疫病…。禽 0．4mlJ只，均为腹腔注射，每次免疫间隔 10d。三次免疫后 流感于 1878年首次发生于意大利，现在几乎遍布世界各地 ， 10d，采血测定血清Hl效价 ，HI≥8log2，摘取眼球制备阳性血 严重危害畜牧业 、养殖业发展和公共卫生安全。1994年在我 清 ，一2O℃冰箱冻存备用 ，HI8log2，继续用病毒液加强。 国广东某鸡场首次分离到 H9N2亚型禽流感病毒，此后， 1．4 酶标板均一性的检测 H9N2禽流感病毒在我国一直呈上升趋势，严重制约了养禽 随机抽取96孔酶标板3包，每包取2块，采用相同条件 业的发展。当前我国对禽流感采取免疫预防为主的防控措 包被抗原检测阴性、阳性血清，比较各酶标板阴性孔和阳性孔 施，免疫效果的好坏可以通过检测抗体来确定，快速、准确的 之间是否存在明显数值差异。 禽流感抗体检测方法对有效控制禽流感疫情 、维护公共卫生 1．5 ELISA抗原的纯化 安全均具有十分重要的意义。本试验利用纯化的全病毒作为 采用红细胞吸附释放法 (AR—RBC) 浓缩纯化禽流感 抗原，建立检测 H9N2亚型禽流感抗体的间接ELISA方法，为 病毒。新鲜红细胞浓缩纯化禽流感病毒：取鸡胚尿囊液毒 临床血清样本中H9N2亚型禽流感抗体的检测提供一种特异 15mL，2000r／min离心30min，去沉淀，留上清液；将 300IxL 性强、敏感性高、使用方便、快捷的方法。 新配制的50％鸡红细胞加入该上清液中混匀，置 4℃下 40min，1500r／min离心 10min，弃上清液；沉淀中加入50 1 材料与方法 生理 盐 水悬 浮 ，37℃水 浴 4h，每 20min振 摇 1次， 1．1 病毒 1500r／min离心 10min，取上清液，测定血凝价后冻存。 H9N2亚型禽流感病毒 Fr毒株为笔者所在的实验室保 甲醛处理的红细胞浓缩纯化禽流感病毒：取 1mL新配制 存 ，将它接种于9—11日龄的SPF鸡胚上，收获24～96h内 的50％鸡红细胞加入 1