一株草鱼呼肠孤病毒弱毒株的分离、鉴定及免疫原性初步分析.pdfVIP

第35卷 第5期 水 生 生 物 学 报 Vo1．35，N O．5 2011年 9月 AC：TA HYDROBIOLOGICA SINICA Sep．， 20 11 DOI：10．3724／SP．J．1035-2011．00790 一 株草鱼呼肠孤病毒弱毒株的分离、鉴定及免疫原性初步分析 曾伟伟 王 庆 刘永奎 ，2 张乐生 刘宝芹 石存斌 吴淑勤 (1．中国水产科学研究院珠江水产研究所，广州 510380；2．上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306) 摘要：从江西南昌患出血病草鱼体 内分离出的草鱼病毒(暂命名为JX09．01)能使草鱼肾脏细胞(CIK)、草鱼肝 细胞(L8824)、草鱼吻端成纤维细胞(PSF)产生明显的细胞病变效应(CPE)。感染CIK细胞固定后经电镜观察， 发现细胞质内有大量病毒聚集，形态和排列方式与已报道的草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus，GCRV)相 似。针对GCRV873株 s6基因设计的简并引物可以从病料组织和感染细胞中扩增 出目的条带，而针对GCRV HZ08株 s6基因设计特异性引物未能扩增出目的条带 。对 JX09．01株的s6全基因进行序列分析表明，其核 苷酸序列 同GCRV 873株和 HZ08株的同源性分别是 99．3％和 30．4％，推导出的氨基酸序列同源性分别是 98，6％和30％，说明草鱼病毒JX09—01株为草鱼呼肠孤病毒 。用JX09—01株接种当年 8—10cm左右的草鱼，没 有明显的临床症状，不能致草鱼死亡。用传代至 15代的CIK细胞病毒液进行免疫保护试验，结果显示其对 强毒株的免疫保护率达到 86．7％。实验结果初步显示，新分离到的JX09．01为草鱼呼肠孤病毒弱毒株，可作 为弱毒疫苗的候选毒株。 关键词：草鱼呼肠孤病毒；分离；鉴定；序列分析；免疫原性 中图分类号：$941．41 文献标识码：A 文章编号：1000．3207(2011)05．0790—06 草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus，GCRV)隶 分离到的GCRVHZ08株于2009年 已完成全基因组 属水生呼肠孤病毒属，为呼肠孤病毒科一新成员， 测序，部分序列的分析结果已发表，亦从多方面对 是中国大陆分离的第一株鱼类病毒。该病毒主要引 其进行了较为系统的研究 ，】，而其他分离株的研 起中国、朝鲜、越南等亚洲 国家淡水养殖主要品种 究报道近几年则相对较少 。本试验从江西南昌的草 草鱼在鱼种阶段发生出血病，死亡率可高达 60％以 鱼出血病病料中分离到GCRV病毒并对其进行鉴定 上。该病毒流行广、危害大、死亡率高、发病季节 和致病性试验，同时对其免疫原性进行初步分析， 长，严重威胁渔业生产 l【1。草鱼呼肠孤病毒具双层 以期为该病毒在结构蛋 白基因的表达、疫苗免疫、 衣壳，病毒粒子平均直径为 60—70nm，二十面体 诊断及分子生物学等方面的研究奠定基础。 对称，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA组 1 材料与方法 成。 目前己经报道了 10多个分离株 】，不同分离 株在基因组序列、基因组带型、细胞病变、对草鱼 1．1 试验材料 的致病力等方面差异较大，其中对 GCRV 873株研 M199培养基、犊牛血清、胰酶为Gibco公司产 究的较为深入，是第一株完成全基因序列分析的水 品；AMV反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTPs、 生呼肠孤病毒 1]『，也是迄今研究的最为系统最为深 DNAMarker购 自TAKARA公司：TrizolReagent购 入的水生呼肠孤病毒。本实验室2008年从浙江湖州 于Invitrogen公司；T4RNAligase购 自Promega公司； 收稿 日期：2010—10—28；修订日期：2011-04—29