国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法—基孔肯雅病毒-征求意见稿.docVIP

前言 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、广东国际旅行卫生保健中心、汕头出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心。 本标准主要起草人：李小波、李燕、朱俊贤、郑夔、师永霞、黄吉城、苏锦坤 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 国境口岸 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 SN/T 3560-2013 国境口岸黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法3.1 基孔肯雅病毒 Chikungunya virus; CHIKV 一种属于披膜病毒科甲病毒属的Semliki forest（SF）抗原复合群有包膜Vero、C6/36、BHK-21和HeLa等细胞中繁殖并产生细胞病变基因组为不分节段的正链RNA3.2 基孔肯雅热 Chikungunya fever; CHIK 由基孔肯雅病毒引起，经伊蚊传播，以发热、皮疹及关节疼痛为主要特征的急性传染病。3.3 环介导恒温扩增检测方法Loop-mediated Isothermal Amplification; LAMP 一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63左右)保温30－60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。法是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。.1 核酸提取试剂：使用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒1)，详见说明书。 5.2 Bst DNA聚合酶购自广州天骐生物科技有限公司2)。 5.3 灭菌双蒸水。 5.4 LAMP检测的引物组合序列 F3 5’- CGCCCTCTTTAACGGACATG -3’ B3 5’- AATTCGGCGCTGGCTAAG -3’ FIP 5’ - TGCCTTTCTTGCTGGCTGCATA-TACCAGCCTGCACCCATT -3’ BIP 5’ - AGTGTGCGGTGCATTCGATGA-TGCAGCTGAGAATTCCCTTC -3’ F2 5’ - TACCAGCCTGCACCCATT -3’ F1c 5’ - TGCCTTTCTTGCTGGCTGCATA -3’ B2 5’ - TGCAGCTGAGAATTCCCTTC -3’ B1c 5’ - AGTGTGCGGTGCATTCGATGA -3’ 6 样本采集 6.1 人血液样本：静脉采集疑似病人抗凝全血5mL，4℃以下保存运输（参见SN/T 3560-2013）。 6.2 蚊虫样本：采集活蚊后迅速低温冷冻（参见SN/T 2300-2009）。 7 样本处理 7.1 血样样本处理参见SN/T 3560-2013。 7.2蚊虫样本处理参见SN/T 2300-2009。 7.3 RNA提取按照试剂盒说明书进行（参见SN/T 2300-2009）。 1) ,2) 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 8 LAMP检测 8.1 cDNA制备 cDNA制备利用宝生物公司的PrimeScriptTM RT reagent kit逆转录试剂盒进行。 40μl cDNA合成反应体系如下： 5×buffer 8μl Enzyme Mix 2μl Oligo dT primer 2μl Random 6mers 8μl RNA 20μl 8.2 LAMP反应体系 构建25μl 的LAMP反应体系： 反应液RM 12.5μl 引物混合物PM 1μl（其中FIP反应终浓度1.6μM，BIP 1.6μM，F3 0.2μM，B3 0.2μM） Bst DNA聚合酶 1μl cDNA 2μl ddH2O 8.5μl 8.3 One-step RT-LAMP反应体系： 构建25μl 的One-step RT-LAMP反应体系： 反应液RM 12.5μl 引物混合