结核病的分子生物学诊断技术研究进展.pdfVIP

山东医药2011年第51卷第3l期 · 综述 与讲座 · 结核病的分子生物学诊断技术研究进展 路 超 。刘义庆 ，王长印，卢志明’ (山东大学附属省立医院，济南250021) 关键词：结核病；结核分支杆菌 ；分子生物学 中图分类号：R52；R34 文献标志码：A 文章编号：1002-266X(2011)31-0112-03 近 10余年来，结核病发病呈全球持续恶化，2007年死 PCR时一个细胞中rRNA数量是DNA的100倍 ，因此扩增产 于结核病的患者约 177万 j。结核杆菌是结核病的主要致 物增多，试验的灵敏度大大提高。该法可用于结核病的诊 病菌 ，可在人群中传播，对外界环境的抵抗力强，易产生耐药 断，缺点是无法区别死菌和活菌。巢式 PCR、半巢式 PCR采 菌株。传统的病原学检查简便易行，但特异性、灵敏度较差， 用内外两对引物，进行两次扩增，内引物以外引物扩增产物 血清学等敏感性或特异性不理想。分子生物学诊断技术是 为模板进行第二次扩增。可提高检测的灵敏度，亦可从临床 一 种简便、快速、灵敏、特异、试剂稳定、无危害性的结核病诊 标本中直接检出结核分枝杆菌，能用于种属鉴别。单管平衡 断和分类鉴定方法 ，现对其研究进展综述如下。 半巢式PCR可有效控制污染，提高扩增效率；单管巢式逆转 1 结核杆菌的分子生物学特点 录PCR可区分死菌与活菌。 1998年英国Sanger中心和法国的Pasteur研究所合作开 2．1．2 在 PCR基础上发展的核酸扩增技术 ①PCR-单链 展了结核分枝杆菌 H37Rv株的全基因组测序工作 J，证实 构象多态性分析(PCR．SSCP)。是检测单碱基突变可靠而简 结核杆菌全基 因组由4411529bp组成，富含许多重复序 便的方法。PCR产物为两条互补单链 ，各单链的碱基序列不 列，尤其是插入序列，亦包括新的基因家族和管家基因。GC 同可形成不同的空间构象，在凝胶上显示不同的带型，可确 碱基含量高达 65．6％，有约3924个开放阅读框 ，其中约 定有无突变。目前采用 PCR—SSCP技术分析耐多药结核杆 4|D％有功能，44％可能有功能，16％称为孤独序列。间隔子 菌的耐药机理已成为研究热点，尤其是该法直接检测临床标 是断裂基因中所具有的非编码序列，结核分枝杆菌的顺向重 本中结核杆菌耐药基因的成功，将会对传统结核药敏试验产 复序列被非重复的独特间隔子(长度 34—41bp)分隔。主 生新的挑战。Sheen等 学者检测比嗪酰胺 的耐药基因，与 要的多态串联重复是结核分枝杆菌染色体中一种主要类型 其他四种技术相比，PER．SSCP技术快速 、高效、价格低廉，对 的重复DNA，由10bp的短串联重复序列被5bp的间隔子分 指导临床治疗及用药有一定应用价值。另有学者用 PER- 隔组成。重组质粒FHtN12包含有一个3．4kb的插入序列。 SSCP技术检测了22株耐多药的结核药菌株 katG、rpoB、rpsl 2001年Fhischmarm等 对结核杆菌 CDC1551全基因组进 基因突变，分别检出突变基因16株、19株、l4株，但该法不 行测序工作 ，并与H37Rv株的序列进行比较，得出基因多样 能确定突变部位和性质 ，对操作技术要求过高，影响因素较 性在结核病发生、发展中扮演重要角色的结论。 多，目前只在条件较好的实验室开展研究。②序列特异引 2 结核病的分子生物学诊断技术 物一多聚酶链反应 (PCR-SSP)。PER—SSP的引物是根据不 2．1 核酸扩增技术 PCR技术及其他体外核酸扩增技术在 同类型核心序列关键几处碱基的差异而设计，产物经 电泳分 结核病领域的应用，为结核病的诊断和鉴别诊断开辟了新途 离，呈现为不 同的阶梯状扩增片段 图谱。墨西哥学者 径。