吸血蠓类DNA条形码标准基因鉴定方法：第2部分.docVIP

ICS FORMTEXT 点击此处添加ICS号 FORMTEXT 点击此处添加中国标准文献分类号 FORMTEXT FORMTEXT SN 中华人民共和国 FORMTEXT 出入境检验检疫行业标准 FORMTEXT SN/T FORMTEXT XXXXX— FORMTEXT XXXX FORMTEXT FORMTEXT 吸血蠓类DNA条形码标准基因鉴定方法 第2部分：操作规程 FORMTEXT The molecular identification of blood-sucking midges based on DNA barcodes—Part 2：Operating procedures FORMTEXT 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 FORMDROPDOWN FORMTEXT （本稿完成日期：2013-11-25） FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX发布 FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX实施 FORMTEXT 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 SN/T XXXXX—XXXX PAGE \* MERGEFORMAT I 前言 SN/T XXXXX 《吸血蠓类DNA条形码标准基因鉴定方法》共分为以下2部分： —第1部分：通用要求； —第2部分：操作规程； 本部分为SN/T XXXXX的第2部分。 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、吉林出入境检验检疫局、福建农林大学。 本标准主要起草人：陈敏、高博、刘阳、张建庆、史灵梅、王飞鹏、肖菲菲、陈颖、谢建勋。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 吸血蠓类DNA条形码标准基因鉴定方法 第2部分：操作规程 范围 本标准规定了国境口岸医学媒介生物实验室采用COⅠ基因进行吸血蠓种类（种间水平）鉴定的操作规范。 本标准适用于国境口岸开展吸血蠓类分子鉴定的医学媒介生物实验室。 标本采集和保存 采用挥网法、CO2灯诱法等方法采集吸血蠓类。采获的吸血蠓类经冷冻处死后，直接保存于95%的酒精中。 CO I基因的扩增和测序 试验材料的准备 吸血蠓切去头、翅和生殖器部分后，将剩余组织置于PCR管中，95%酒精保存，每管一只，并进行唯一性编号，用于DNA提取。若需较长时间保存，应将装有蠓类组织部位的PCR管冻存于-20℃ DNA模板制备 3.2.1 取PCR管中的单个蠓胸段标本于ddH2O中浸洗2～3次，吸水纸上吸干。 3.2.2 将干燥后的标本置于1.5mL Eppendorf管中，加入20μL裂解液，用一次性研磨杵和手持式电动研磨器进行研磨匀浆。 3.2.3 向管中加入1μL 20 mg/mL的蛋白酶K，充分混匀。 3.2.4 置于60℃水浴锅中3 h，中途追加1μL 3.2.5 每管加入178μL的ddH2O，100℃ 3.2.6 吸取150 uL的提取液，加入2倍体积预冷的无水乙醇，冰浴2 h。 3.2.7 12,000 r/m离心20 min，将管倒立在卷纸上，室温干燥DNA沉淀，至乙醇全部挥发。 3.2.8 加入30μL TE缓冲液（pH 8.0），混匀溶解DNA沉淀。 3.2.9 提取的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测是否降解，置-20℃ 引物合成 吸血蠓类COⅠ基因PCR的反应体系 引物序列见第1部分。按表1 顺序依次加入。 表1 吸血蠓类COⅠ基因PCR反应体系（以50uL为例） 成分 体积（uL） 模板 2 引物1 1 引物2 1 2×Mastermix 25 ddH2O 21 吸血蠓类COⅠ基因PCR的反应程序 按表2或表3设置。 表2 吸血蠓类COⅠ基因PCR反应程序（适用L1490/H2198引物对） 步骤 反应温度（℃） 时间 循环数 预变性 94 5 min — 变性 94 45 s 35 退火 48 45 s 35 延伸 72 45 s 35 延伸 72 7 min — 表3 吸血蠓类COⅠ基因PCR反应程序（适用C1-J-1718/ C1-N-2191引物对） 步骤 反应温度（℃） 时间 循环数 预变性 94 3 min — 变性 94 30 s 5 退火 45 90 s 5 延伸 68 60 s 5 变性 94 30 s 35 退火 51 90 s 35 延伸 68 60 s 35 延伸 68 10 min — PCR产物的检测 取PCR产物5μL，用1%琼脂糖电泳，130V电压，电泳35 min。 基因序列测定与相似性比对 将PCR扩增产物送由生物公