入境环保微生物菌剂检测方法 第15部分：解淀粉芽孢杆菌(征求意见稿).docVIP

ICS?点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 ????? SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T XXXX.15—XXXX ????? 入境环保用微生物菌剂检测方法 第15部分：解淀粉芽孢杆菌 Methods for examination of import microbe agentia for environment protection Part 15: Bacillus amyloliquifaciens ????? ????? XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局?????????发布 前????言 本是根据GB/T1.1-1993《标准化工作导则 第一单元：标准的起草与表述规则 第1部分：标准编写的基本规定》的要求编写的。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。入境环保用微生物菌剂检测方法本标准规定了。 本标准适用于。 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 方法原理 取适量入境环保用微生物菌剂，将菌剂中的菌进行活化、分离，对该菌进行形态学和生理生化试验，并进行，三项实验结果。 实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。 ：见附录A中A.章：见附录A中A.章TE缓冲液（pH值8.0）：见附录A中A.章10×PCR缓冲液：200mmol/L Tris-HCl(pH8.4) 200mmol/L氯化钾（KCl）15mmol/L氯化镁（MgCl2）。 dNTP: dATP、dTTP、dGTP、dCTP。 TBE：54gTris，27.5g硼酸，800ml去离子水溶解，20ml 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)定容至1L。 Taq DNA聚合酶。 细菌基因组DNA提取试剂盒。DNA分子量标记：100 bp DNA ladder。电子天平（感量0.01 g）。 36 ℃±1 ℃、50 ℃±1 ℃。 恒温水浴锅。 台式离心机（最高转速15 000 r/min）。 PCR扩增仪。 实时荧光PCR仪。 头：10μL、20μL、200μL、1000μL。 PCR超净工作台。 电泳仪。 核酸/蛋白分析仪。 凝胶成像系统。 。100μL。 解淀粉芽孢杆菌形态学及生化特征： 解淀粉芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌，细胞直径＜1μm，内生孢子，芽孢不膨大，不形成伴胞晶体。生化特征见表1。 解淀粉芽孢杆菌生化特征 鉴定项目 解淀粉芽孢杆菌 接触酶 + 氧化酶 + 厌氧生长 +/- 葡萄糖 + 木糖 + L-阿拉伯糖 + + 利用葡萄糖产气 - 利用柠檬酸盐 + 硝酸盐还原 - 50℃生长 + pH5.7生长 + 7%NaCl生长 + + 明胶液化 + 细菌模板DNA的提取 直接提取法 取7.2中菌液2mL加到2mL无菌离心管中，10000rpm离心2分钟，尽量弃净上清，沉淀加入TE100μL、10mg/ml溶菌酶100μL，37℃温育30min，12000rpm离心2分钟，沉淀加入TE缓冲液600μL重悬，再加入15mg/ml蛋白酶Ｋ25μl，55℃温育1h后沸水浴10min，12000rpm离心5分钟，取上清保存于－20℃保存以待检测。 有机溶剂提取法 取7.2中菌液2mL加到2mL无菌离心管中，10000rpm离心2分钟，弃上清，尽量弃净上清，沉淀加入TE缓冲液570μL重悬，然后加入10mg/ml溶菌酶100μL，37℃温育30 min，再加入10%SDS 30μL，65℃温育10min，加入等体积的酚混匀，12000rpm离心10分钟，取上清移入一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚／氯仿（1:1,体积比）混匀，12000rpm离心10分钟，取上清再移入一新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用500μL75%乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇挥发，加入100μL无菌水（预先加热至65℃有利于DNA溶解），－20℃保存以待检测。 试剂盒法 使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。 DNA质量检测 将提取的