入境环保微生物菌剂检测方法 第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌.docVIP

ICS点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T XXXXX—XXXX 入境环保微生物菌剂检测方法 第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌 Methods for examination of import microbe agentia for environment protection Part 4: Acidithiobacillus ferrooxidans 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发布 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：王金玲、李成镛、金艳、赵颖、贾林、李瑶、王芳。 境环保微生物菌剂检测方法 第4部分 嗜酸氧化亚铁硫杆菌 范围 本标准规定了入境环保微生物菌剂嗜酸氧化亚铁硫杆菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于入境环保微生物菌剂嗜酸氧化亚铁硫杆菌检测和鉴定。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 方法原理 3.1 分类地位 种名：Acidithiobacillus Ferrooxidans 分类地位：原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。 3.2 鉴定原理 取适量入境环保微生物菌剂，将菌剂中的菌进行活化、分离，对该菌进行形态学和生理生化试验，并进行PCR扩增或实时荧光PCR扩增，综合三项实验结果判定是否是目的细菌。 PCR扩增鉴定原理：针对环境样品中浓度极低的嗜酸氧化亚铁硫杆菌rus基因中的保守序列，设计两对引物，第一次PCR反应扩增一对外引物之间的序列，扩增产物作为第二次PCR反应的模板，扩增内引物之间的rus基因中 218 bp保守序列。 人员防护 取样人员在对微生物菌剂的取样过程中，参照我国病原微生物实验室生物安全管理条例，做好个人防护。为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测，所有培养物应小心处置。并参见GB19489中的有关规定执行。 主要试剂和培养基 5.1 实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格） 5.2 9K液体培养基：见附录A中A.1章。 5.3 9K固体培养基：见附录A中A.2章。 5.4 硫代硫酸钠：见附录A中A.3章。 5.5 葡萄糖：见附录A中A.4章。 5.6 蔗糖：见附录A中A.5章。 5.7 丙三醇：见附录A中A.6章。 5.8 蛋白胨：见附录A中A.7章。 5.9 9K+葡萄糖：见附录A中A.8章。 5.10 9K+蛋白胨：见附录A中A.9章。 5.11 磷酸二氢铵：见附录A中A.10章。 5.12 碳酸铵：见附录A中A.11章。 5.13 硝酸钾：见附录A中A.12章。 5.14 PH 1：见附录A中A.13章。 5.15 PH 2：见附录A中A.14章。 5.16 PH 3：见附录A中A.15章。 5.17 二苯胺磺酸钠指示剂：见附录A中A.16章。 5.18 0. 0167mol/ L的重铬酸钾：见附录A中A.17章。 5.19 TE缓冲液（pH值8.0）：见附录A中A.18章。 5.20　10×PCR缓冲液：200mmol/L Tris-HCl(pH8.4)，200mmol/L氯化钾（KCl）15mmol/L氯化镁（MgCl2）。 5.21　dNTP: dATP、 dTTP、 dGTP 、dCTP。 5.22　TBE：见附录A中A.19章。 5.23 Taq DNA 聚合酶。 5.24 细菌基因组DNA提取试剂盒。 5.25 50×TAE缓冲液（pH值8.5）：见附录A中A.20章。 5.26 琼脂糖。 5.27 溴化乙锭。 5.28 DNA分子量标记：100 bp DNA ladder。 主要仪器和设备 6.1 电子天平（感量0.01 g）。 6.2 恒温培养箱：30 ℃±1 ℃。 恒温振荡培养箱：30 ℃±1 ℃。 6.3 恒温水浴锅。 6.4 台式冷冻离心机（最高转速15000 r/min）。 6.5 PCR扩增仪。 6.6 实时荧光PCR仪。 6.7 微量移液器和灭菌吸头：10 μL、 20 μ