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ICS（不用填） SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 XX/T XXXXX—XXXX 葡萄金黄化植原体检疫鉴定方法 Detection and identification of Grapevine flavescence dorée phytoplasma （本稿完成日期：2013.9.4） XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009的规则起草。葡萄金黄化植原体检疫鉴定方法 范围 本标准规定了葡萄金黄化植原体的检疫和鉴定方法。 本标准适用于进出境葡萄及其苗木中葡萄金黄化植原体的检疫和鉴定。 葡萄金黄化植原体基本信息 英文名：Grapevine flavescence dorée phytoplasma 分类地位：软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales），非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（Phytoplasma）的附录A。性的主要依据。DAPI染色和超薄切片透射电镜观察的形态学为初步筛查方法；以植原体核糖体16S rDNA序列特征为主要的判定依据。 仪器用具和主要试剂 仪器 PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、台式冷冻离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、荧光显微镜、透射电子显微镜、超薄切片机等。 用具 移液器、研钵、离心管、PCR管、量筒、烧杯、镊子等。缓冲液CTAB 2% (w/v) Tris-HCl 100 mmol/L（pH 8.0） EDTA 20 mmol/L（pH 8.0） NaCl 1.4 mol/L PVP-40 1% (w/v) PBS缓冲液无水NaH2PO4 NaOH 4.9g 加水定容至1000mL。 其他试剂、氯仿、、丙醇、乙醇、琼脂糖、、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物等。 检测鉴定方法 症状观察 现场查验 现场对葡萄苗木进行观察，症状描述参见附录A，选取可疑症状植株样品和随机样品带回实验室检测。 DAPI染色 选取幼嫩组织（新叶叶梗、枝梢、茎秆及根部韧皮部组织），切片，用1μg/mL DAPI溶液（4,6-二脒基-2-苯基吲哚取0.1 g置于预冷的研钵中，在中研磨成粉末状，迅速转入1.5 m 的离心管中。加入800 μ 65℃预热的CTAB提取缓冲液，涡旋振荡充分混匀，65 ℃水浴50 min，每隔 10 min轻轻颠倒混匀一次。冷却至室温，加入等体积的的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻颠倒混匀，静置10 min，4 ℃10000 r/min离心10 min，取上清。加入等体积异丙醇或2倍体积无水乙醇，轻轻颠倒混匀，出现DNA絮状沉淀，在冰上放置30 min沉淀DNA，4 ℃12000 rmin离心10 min，弃上清，离心管倒置滤纸上干燥，用800μ 70 %冰乙醇清洗沉淀两次，以除去盐离子等。加入800μ 70 %冰乙醇后，轻轻颠倒离心管几次，将沉淀于底部的DNA弹起，放置离心管10 min，4 ℃ 10000 r/min离心1 min，弃上清风干去除乙醇。加入200μ TE溶解DNA沉淀-20 ℃保存备用。 也可采用试剂盒提取。引物p左右）进行序列测定，在Genebank中进行序列比对。 结果判定 形态学鉴定 表现症状与A.1描述一致且5.1.2检测实验中DAPI染色观察结果显示蓝色荧光，或5.1.3中通过电子显微镜观察，发现韧皮部筛管中含有直径为500～1000μm的圆形、椭圆形、不规则形状等的菌原体，可初步判定为植原体。 分子生物学鉴定 初步判定为植原体病害的植物材料，经5.3和5.4步骤后，出现500bp左右特异性条带，且该条带测序结果与genebank中葡萄金黄化植原体（flavescence doree phytoplasma）的相似度达99%以上，即可判定为葡萄金黄化植原体。 样品保存与复核 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出葡萄金黄化植原体的样品应保存于-20 ℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满6个月后须经高压灭菌后方可处理。 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳照片，并附DNA测序原始图谱及限制性内切酶指纹图谱。 （资料性附录）葡萄金黄化植原体资料 表现症状及危害 葡萄金黄化与其他引起葡萄黄化的植原体病害不易区分，症状为叶片褪绿，朝下反卷，花序枯死