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ICS SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T XXXXX—XXXX 口蹄疫非结构蛋白抗体检疫技术规范 Protocol of quarantine for antibodies against non capsid proteins of the foot-and-mouth disease virus XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局 本标准主要起草人：王玉玲、肖妍、刘国红、柴铭骏、张俊哲口蹄疫非结构蛋白抗体检疫技术规范 范围 本标准规定了口蹄疫非结构蛋白抗体间接酶联免疫吸附试验、非结构蛋白抗体酶联免疫电转移印迹试验等技术要求。 本标准适用于牛的口蹄疫非结构蛋白抗体检测，羊、猪等动物可参考执行。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 概述 参见附录A。 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行口蹄疫非结构蛋白抗体的检测，应当采取预防气溶胶感染的安全措施。按照GB 19489 中的有关规定进行操作。 被检血清样品 按常规方法采血和分离血清 血清应新鲜，无腐败。 运送和保存血清 防止血清受热，若3 d内不能送到实验室，需用冷藏方法运送血清。血清应放至4 ℃冰箱内备用，如需长期保存，应置-20 ℃冰箱内。 口蹄疫非结构蛋白抗体间接酶联免疫吸附试验 试剂和材料 96孔平底微量板 试验用蒸馏水为GB/T 6682 中的三级水。 口蹄疫非结构蛋白抗体间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒：由非结构蛋白包被的抗原包被板、结合物（辣根过氧化物酶标记抗体）、阳性对照血清、阴性对照血清、底物、终止液、洗液、稀释液及其它必要的试剂组成。 仪器和设备 洗板机 温箱 酶标仪 涡旋振荡器 天平 台式离心机 可调微量移液器 试验原理 用口蹄疫病毒非结构蛋白包被ELISA微量反应板。当加入被检血清样品时，如果样品中含有非结构蛋白抗体，则与包被的非结构蛋白特异性结合，形成抗原抗体复合物，未结合的物质通过洗涤从微量反应板上洗去。加入酶标抗体后，抗原抗体复合物与之结合，未结合的物质通过洗涤洗去。再加入底物后，底物与结合抗原抗体复合物的酶标抗体发生显色反应；如果样品中不含有非结构蛋白抗体，则不能与包被的非结构蛋白结合，不能形成抗原抗体复合物，酶标抗体不会结合，加入底物后不显色。微量孔颜色的深浅与样品中非结构蛋白抗体的量成正比，通过酶标仪读取光密度值判定样品的阴、阳性。 试验程序 试验前预准备 在试验前1 h左右，将试剂盒中要求提前取出的试剂和包被板取出，于室温（20 ℃～25 ℃）下放置，使试剂恢复至室温状态。试剂用后需放回冰箱的，应在用后放回冰箱中。应在使用前从冰箱中取出的试剂，在用后应放回冰箱中。 将试剂盒中的试剂按要求作稀释。 正式试验 按试剂盒的要求将稀释液、被检血清样品、阳性对照血清、阴性对照血清等加至对应的孔内，取每个样品应用新的滴头。每板的样品应在10 min内加完。如果需要先在稀释板上进行样品、对照血清稀释的或在10 min内不能加完样品的，应先在96孔稀释板上进行样品的稀释，反复吹吸几次后，移取稀释后的样品加入反应板中相应孔内。 封板，37 ℃±0.5 ℃温箱中孵育。 需配制结合物工作液的，应在孵育结束前5 min～10 min配制结合物工作液。 样品孵育结束后，将板迅速翻转倒掉板内液体至废液缸后，在干净的吸水纸上扣至无液体流出，放置洗板机上洗板或手工洗板6次，手工洗板时应在每次洗板后，将板翻转倒掉板内液体，并在干净的吸水纸上扣至无液体流出。洗板结束后，将板翻转至干净的吸水纸上扣至无液体流出。 取结合物工作液加至反应板的每个孔内，封板，37 ℃±0.5 ℃孵育。 需配制底物工作液的，在结合物孵育结束前5 min～10 min配制底物工作液。 结合物孵育结束后，将板迅速翻转倒掉板内液体至废液缸后，在干净的吸水纸上扣至无液体流出，放置洗板机上洗板或手工洗板6次，手工洗板时应在每次洗板后，将板翻转倒掉板内液体，并在干净的吸水纸上扣至无液体流出。洗板结束后，将板翻转至干净的吸水纸上扣至无液体流出。 取底物工作液加至反应板的每个孔内，按试剂盒要求的温度下孵育。 底物孵育结束后，取终止液加至反应板的每个孔内，终止液的加入顺